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甲状腺转录因子—2在C57BL／6J小鼠腭突发育过程中的时空变化

目的探讨C57BL/6J小鼠继发腭发育过程中，甲状腺转录因子（TTF）-2表

达的时空变化规律，探讨TTF-2在腭突形成中的作用。方法于小鼠妊娠12、13、

14、15d分别断颈处死各6只孕鼠，无菌条件取出胚胎，解离腭突。应用逆转录

聚合酶链反应（RT-PCR）、Westernblot和免疫组织化学染色方法定量、定位检

测TTF-2在腭突中的表达。结果免疫组织化学定位检查在C57BL/6J小鼠的腭

突发育过程（E12-E14）中，在腭突中嵴上皮细胞均有TTF-2的表达，而在腭突

间充质细胞未见TTF-2的表达；腭突融合时，已不能检测到TTF-2表达。TTF-2

在腭突形成、上抬、接触的表达差异具有统计学意义（P＜0.05），以E13为最高，

RT-PCR和Westemblot结果一致。结论TTF-2在腭突发育过程中的表达有时空

性，推测TTF-2与腭突中嵴上皮细胞的分化抑制和转归相关。

标签：甲状腺转录因子-2；腭中嵴上皮；逆转录聚合酶链反应；免疫组织化

学

哺乳动物继发腭的发育是一个复杂过程，涉及到将口鼻腔正确分离的几个过

程的协调一致，从腭突产生即胚胎第12天（E12）、上抬即胚胎第13天（E13）

到两侧腭突相对运动接触直至融合即胚胎第14、15天（E14、E15），最后覆盖

在口腔侧和鼻腔侧的黏膜分别分化为复层鳞状上皮和假复层纤毛柱状上皮，这些

过程中任何一个环节发生改变都可引起腭裂。

甲状腺转录因子（thyroidtranscriptionfactor，TTF）-2属于叉头/螺旋翼结构

域蛋白家族，TTF_2-/-小鼠和人类TTF-2基因纯合缺陷表现为腭裂及甲状腺发育

不全等畸形。在小鼠发育过程中，TTF-2有促进甲状腺前体细胞迁徙，抑制甲状

腺前体细胞在迁徙过程中分化功能，但对腭突中嵴上皮细胞分化抑制是否有影

响，尚不清楚。本研究旨在观察在继发腭发育过程中，TTF-2的表达部位及其时

空变化变化规律。

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物成年C57BL/6J小鼠（四川大学华西医学中心动物中心），雌

鼠4-6周，体质量为12-14.5g；雄鼠大于6周龄，体质量大于20g，保持12h

昼夜周期制，室温控制在20-25℃，充足食物，自由饮水（pMR为5）。

1.1.2主要试剂组织RNA提取试剂盒（CodeNo.SK1409，上海生工生物工

程技术服务有限公司），cDNA合成试剂盒（CodeNo，D6120）、聚合酶链反应

（polymerasechainreaction，PCR）试剂盒（CodeNo.DR500A）购自宝生物工程

（大连）有限公司，组织细胞蛋白裂解液RIPA（上海申能博彩生物科技有限公

司），TTF-2羊抗小鼠多克隆IgG（CodeNo，SC-16392）、Actin（I-lq）羊抗小鼠

多克隆IgG（CodeNo.SC-1616）（SantaCruz生物技术公司，美国）；ProteinDetecter

WesternBlotKitBCIP/NBTSystem（CodeNo.55-11-50，KPL公司，美国）、聚偏

二氟乙烯（poly-vinylidenefluoride，PVDF）膜（MerckMillipore公司，德国）、

即用型过氧化物酶免疫组化试剂盒（CodeNo.SAl023，武汉博士德生物工程有限

公司）。

1.1.3主要仪器半干式电转膜仪（Bio-Rad公司，美国）、PCR仪（EppendorfO

国有限公司）。

1.1.4PCR引物以反转录获得的eDNA为摸板，根据TTF-2DNA的序列设

计的引物进行PCR反应。上游引物：5’-CTGTGGACAATCACAATGG-3’；下游

引物：5’-CCGACTTAGGGATGAAGG-3’；产物508bp。内参照根据小鼠磷酸

甘油醛脱氢酶（reducedglyceraldehyde-phosphatedehydrogenase，GAPDH）基因

设计引物。上游引物：5’