DB32T 2570-2013 鸡传染性法氏囊RT-LAMP 诊断技术规程　.docxVIP

ICS65.020.99B22

备案号：40456-2014

DB32

江苏省地方标准

DB32/T2570-2013

鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程TechnicalcodeofdetectingRT-LAMPforInfectiousBursalDisease

2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布

DB32/T2570-2013

前言

为规范鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程，提高鸡传染性法氏囊病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》要求编写。本标准的附录为规范性附录。

本标准由江苏省农业科学院提出。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准起草人：刘宇卓、李银、黄欣梅、赵冬敏、韩凯凯、张敬峰。

5临床诊断

DB32/T2570-2013

鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程

1范围

本标准规范了鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程所用引物、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。

本标准适用于鸡传染性法氏囊病毒病的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查、分离毒株的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法

DB13/T500商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程

3主要试剂和仪器

3.1DNAMarkerDL-20003.26xLoadingbuffer

3.3BstDNAPolymerase

3.4MgSO

3.5DEPC

3.6Betaine

3.710XThermoPolbuffer

3.8异丙醇

3.9无水乙醇

3.10琼脂糖

3.11核酸染料

3.12氯仿

3.13电泳仪

3.14电热恒温水槽

4引物

按照GenBank上公布的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)A节段的基因序列(GenBankAY444873),在VP3基因保守区域利用LAMPprimerdesigningsoftwarePrimerExplorer设计一套引物，序列为：

F3:5′一CCAACTGGGCGACGTTTA一3

B3:5′一CAGAATGGAACAGTGGGTCC一3

FIP:5′一GTCCTGCATTGGGTGGAAGGTATTTTTTTTCCTCACAATCCACGCG一3

BIP:5′一CTGGCTATGGCCGCTTCAGATTTTTGCTGCTTCCATGGCTCT一3

2

DB32/T2570-2013

按照DB13/T500商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程中4.1流行特点、4.2临床症状、4.3.1剖检病变进行。

6采样和样品的处理

6.1病料的采集及处理

按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸡，无菌采集法氏囊及肾脏、肝脏组织，于0～4℃冷藏保存并立即送检，采样过程中样品不得交叉污染。

6.2样品的处理

剖检取法氏囊及肾脏、肝脏组织，可单独使用，也可混合后使用。取上述病料或经鸡胚接种后的绒毛尿囊膜及胚体，置无菌研钵中剪碎并研磨，-20℃反复冻融三次，将研磨好的组织以4℃12000rpm离心10min,取上清备用。

7RT-LAMP

7.1RNA的提取

取已处理的待检样品，以已知IBDV病毒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，每管依次加入Trizol□600HL,振荡混匀后，室温放置10min,加入氯仿200HL,剧烈振荡后，室温放置1min,4℃12000rpm,离心15min,取上层水相750HL,加入500H异丙醇，混匀，-20℃放置15min,4℃10000rpm离心10min,去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000rpm离心5min,去上清，室