第三章 细胞生物学研究方法_1课件.ppt

第二章细胞生物学研究方法;本章内容提要

第一节显微技术

一、光学显微镜

二、电子显微镜

三、显微操作技术

第二节细胞组分的分析方法

第三节细胞培养与细胞杂交

;第一节显微技术

光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。

电子显微镜：以电子束为光源。

;—、光学显微镜;第三章细胞生物学研究方法_1;第三章细胞生物学研究方法_1;3、最高分辨率：0.2um，由光的波动性质决定（最小波390nm）

R=0.61λ

N．sinα/2

4、三个条件：

1必须用聚光透镜将一束亮光聚焦到样品上

2需制备样品，使之透光

3设置一套合适的透镜组

;;;;;（二）荧光显微镜

?特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜

?有两个特殊的滤光片

?照明方式通常为落射式

;;用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

;（三）激光共聚焦扫描显微境（LCSM）

?用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描

?能显示细胞样品的立体结构。

?分辨力是普通光学显微镜的3倍。

?用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。

;;;;二、电子显微镜;原理

以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50－120KV)的平方根成反比

?由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成

?分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。

?用于观察超微结构，即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。

;不同光线的波长

;第三章细胞生物学研究方法_1;2、制样技术;第三章细胞生物学研究方法_1;2）负染技术

?用重金属盐(如磷钨

酸)对铺展在载网上

的样品染色；吸去

染料，干燥后，样

品凹陷处铺了一层

重金属盐，而凸的

出地方没有染料沉

积，从而出现负染

效果，分辨力可达

1.5nm左右。

;3）冰冻蚀刻

?亦称冰冻断裂。标本置于

干冰或液氮中（－196℃）

然后断开，升温后，冰升

华，暴露出了断面结构。

向断裂面上喷涂一层蒸汽

碳和铂。然后将组织溶掉，

把碳和铂的膜剥下来，此

膜即为复???（replica）。

;（二）扫描电子显微镜;工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

扫描电镜主要用来观察样品表面的形貌特征，为避免干燥过程中样品因表面张力的作用发生变形，常采用二氧化碳临界点干燥法。

为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

;;;;（三）扫描隧道显微镜（STM）

?原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV－2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。

?分辨率：横向为0.1－0.2nm，纵向可达0.001nm。

?用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。

;扫描隧道显微镜原理

;思考：

比较电子显微镜和光学显微镜的优点及缺点。对下列目标你用什么方法做最佳观察：一个活的皮肤细胞、一个酵母线粒体、一个细菌、一条微管

能否用透射式电子显微镜反映样品的表面立体形貌，而用扫描式电镜反映样品内部的状况。;三、显微操作技术;显微操作仪;第二节细胞组分的分析方法;（一）差速离心

?特点：

–介质密度均一；

–速度由低向高，逐级离心。

?用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

?沉降顺序：核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高基体—核蛋白体。

?可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

;;（二）密度梯度离心

?用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。

?类型：速度沉降、等密度沉降。

?常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

?分离活细胞的介质要求：

–1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

–2）PH中性或易调为中性；

–3）浓度大时渗透压不大；

–4）对细胞无毒。

;四、免疫细胞化学;五、放射自显影术;二、流式细胞术;第三章细胞生物学研究方法_1;三、细胞电泳;第三节细