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********************************************3、常用工具酶限制性内切酶(restrictionendonuclease)DNA连接酶逆转录酶S1核酸酶(切单链DNA/RNA)碱性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)*限制性内切酶(restrictionenzyme
或restrictionendonuclease)限制性内切酶是微生物的一种自我保护酶,它能识别双链DNA分子中某一段特异碱基序列并切开。识别的DNA序列多数为4-6个碱基,也有8个碱基的。识别序列都具有回文结构的特点。“分子手术刀”*“分子剪刀”的发现者*命名原则:EcoRⅠ
细菌属名种名株系编号 识别DNA序列的碱基数:4—6个切除机率多8个切除机率少分析大片段DNA识别序列:回文/双重对称结构切口:粘性末端平端末端*限制性内切酶切口有两种:
1.粘性末端(cohesiveend或stickyend)
2.平端末端(bluntend)
★平末端(bluntend)
在识别顺序的对称轴上,对双链DNA同时切割。
HpaIHpaI
5’GTTAAC3’5’GTT+AAC3’
3’CAATTG5’3’CAATTG5’
*★5’端粘性末端(cohesiveend)
在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的5’末端切割。
EcoRI
EcoRI
5’GAATTC3’5’G+pAATTC3’
3’CTTAAG5’3’CTTAAp+G5’
*
★3’端粘性末端
在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的3’末端切割。
PstI
PstI
5’CTGCAG3’5’CTGCA+pG3’
3’GACGTC5’3’GpACGTC5’
*粘性末端拼接法图12-25*分类及作用:I型、II型、III型
II型酶的识别
识别序列一般为4-6个碱基对,
具有回文结构。
*II型限制酶的用途
(1)构建DNA重组体、克隆及亚克隆
(2)DNA杂交与序列分析
(3)改建质粒
(4)构建基因组DNA物理图谱和文库等
*(一)原核细胞转化作用(transformation):以改变细胞的通透性,将重组DNA分子,引入原核细胞,如大肠杆菌,使其在细菌体内扩增及表达的过程。
三、重组DNA分子引入宿主细胞感染(infection):以噬菌体为载体的重组DNA分子,经体外包装成具有感染性噬菌体,可感染合适的大肠杆菌,使其在细菌内繁殖。*(二)动物细胞转染作用(transfection):用磷酸钙使外源DNA形成沉淀颗粒,颗粒沉着在动物细胞的表面,可被细胞摄取,而改变细胞的性质。微注射法(microinjection):将外源DNA分子直接注入细胞或核内。
*转基因(transgenic):将重组DNA分子注射入单细胞受精卵的核内,使子代的全身各组织细胞都含有DNA,研究整体条件下外源DNA的功能。
*四、筛选(一)转化细菌的筛选含有重组质粒DNA菌落的选择,主要是根据抗药性标志(二)噬菌体的筛选常根据噬菌体所含的LacZ基因是否被插入片段破坏来筛选*(三)菌落或噬菌斑原位斑点杂交(四)蛋白质表达产物的测定可用放射免疫方法来筛选*抗药性标志外源DNA片段插入pBR322的P
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