分子生物学研究方法课件.ppt

*12-分子生物学研究方法实验方法：首先利用基因重组技术将编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体上。导入酵母细胞中，使之表达带有BD的融合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。*12-分子生物学研究方法实验方法：一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因。*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法Farwestern-体外蛋白质相互作用技术*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证（westernblot等）蛋白信息的初步获得*12-分子生物学研究方法蛋白质的质谱分析技术基质辅助激光解析电离：飞行质谱仪(MALDI-TOF)。电喷雾质谱ESI-MS：*12-分子生物学研究方法从2D胶中分离得到的或其它来源的蛋白质，酶解成小肽后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体的待分析物从靶表面喷射出去。离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷，这些气体肽段在电场中被加速后，到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m/z)决定。*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法生物质谱的一般流程：蛋白酶解成肽段。肽段分离。离子进入质谱，得到质谱图。用计算机软件将质谱图与蛋白数据库进行比对，从而鉴定出蛋白。*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法基因表达系列分析技术基因表达系列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)是以DNA序列测定为基础，定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。LongSAGE；ShortSAGE。*12-分子生物学研究方法在转录组水平上，任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标签。将这些序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法*12-分子生物学研究方法原位杂交技术(insituhybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位或相对定量研究的一种手段。分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。*12-分子生物学研究方法RNA原位杂交：用放射性或非放射性(地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或酶促免疫反应显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。*12-分子生物学研究方法荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)：首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。*12-分子生物学研究方法按标记物不同又可分为直接标记法和间接标记法。用生物素(biotin)或地高辛配体(digoxingenin)标记称为间接标记，杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号，因而步骤较多、操作麻烦，其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大，需进行染色体定位的基因片段往往较小，因而间接标记具有其优势。*12-分子