MiR-103a-3p靶向TRIAP1抑制慢性髓细胞白血病细胞系K562增殖的机制研究.pdfVIP

MiR-103a-3p靶向TRIAP1抑制慢性髓细胞白血病细胞系K562增殖的机

制研究

摘要

目的：慢性髓细胞白血病（ChronicMyeloidLeukemia，CML）是以费城染色体为特征

的克隆性骨髓增生性肿瘤。越来越多的microRNAs被认为是CML的关键调控分子，其

表达水平与患者的临床预后有着显著的相关性。本研究的目的在于探究miR-103a-3p-

TRIAP1轴在CML发展中的生物学机制，为CML治疗提供分子靶点。

方法：

1.运用实时荧光定量PCR（RealTimeQuantitativePCR，RT-qPCR）技术，对32例CML

患者与20例健康供者的骨髓样本，以及人慢性髓细胞白血病细胞（K562）和人骨髓基

质细胞（HS-5）中的miR-103a-3p和TRIAP1的表达水平进行检测。

2.合成了过表达miR-103a-3p的化合物（agomiR-103a-3p）及其阴性对照（agomiR-103a-

3pNC），以及TRIAP1的小干扰RNA类似物（Si-TRIAP1）及其对照（Si-control）。借

助Lipo3000脂质体转染技术对K562细胞进行转染，并通过RT-qPCR技术验证了转染

效果。

3.为探究过表达miR-103a-3p或敲低TRIAP1对K562细胞增殖能力的影响，我们采用

了细胞数量试剂盒（CCK-8）进行检测。

4.为探究上述处理对细胞凋亡的影响，利用AnnexinV-FITC/PI染色法进行评估。

5.采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）技术，对细胞中的关键凋亡相关蛋白促凋亡蛋

白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平进行了定量检测。

6.运用生物信息学方法对miR-103a-3p和TRIAP1间的靶向结合能力进行了预测。通过

双荧光素酶报告基因实验，验证了miR-103a-3p可以和TRIAP1基因的3非翻译区

（3UTR）特异性结合，用RT-qPCR技术检测了过表达miR-103a-3p后，K562细胞中

TRIAP1的mRNA及蛋白表达水平。为探究miR-103a-3p与TRIAP1的直接调控关系，

利用生物信息学方法预测了两者的结合能力，并通过双荧光素酶报告基因实验验证了

miR-103a-3p与TRIAP13UTR之间的靶向结合作用。此外，采用RT-qPCR及Western

blot技术，还检测了过表达miR-103a-3p后TRIAP1的mRNA和蛋白表达水平。

7.为进一步在体内探究miR-103a-3p的功能，构建了稳定表达miR-103a-3p的K562细

胞系，并将其注射到SCID-Beige小鼠体内，观察其对SCID-Beige小鼠肿瘤的体积和

质量的影响。

8.为了解过表达miR-103a-3p对组织形态学的影响，用苏木精-伊红染色法

（Hematoxylin-eosinstaining，HE）染色后观察组织的炎症浸润、增生及坏死程度。免

疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）实验检测了Ki-67的表达变化，验证过表达

miR-103a-3p后对细胞增殖的抑制情况。

结果：

1.RT-qPCR结果表明，CML患者与健康供者相比，miR-103a-3p明显下调（t=3.317，

P0.01），而TRIAP1表达水平明显升高（t30.270，P＜0.0001）。与正常对照细胞HS-

5相比，K562细胞中miR-103a-3p明显降低（t=21.430，P0.0001），而TRIAP1则显著

增加（t=11.290，P＜0.001）。

2.RT-qPCR验证了miR-103a-3p过表达物的转染效果良好（t=6.600，P＜0.0010），TRIAP1

敲低物的转染效果良好（t=4.927，P＜0.01）。

3.细胞功能实验结果显示，过表达miR-103a-3p能够抑制K562细胞的增殖

（t=4.949~12.170，P0.01）、促进凋亡（t=3.181，P＜0.05