荧光定量PCR原理-扩增曲线.pptVIP

质粒标准品的制备01PCR02目的基因克隆03质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用04目的基因05目的基因06目的基因07质粒08目的基因09基因组DNA待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014拷贝数的计算：011v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v倍比梯度稀释方法：02质粒标准品稀释方法与拷贝数计算绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量扩增效率（E）计算E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1=2.03－1＝1.03标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52R2=0.9988绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36=229087copiesX=20.5-37.52-3.1726=5.36相对定量解析方法相对定量的必要性理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTPPPO01双标准曲线法-△△Ct法02相对定量分析——两种常用的分析方法相对定量分析——双标准曲线法通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。管家基因定量结果相对值=公式：对照样品的校正值校正值=待测样品的校正值目的基因定量结果*****荧光定量PCR技术专题荧光定量PCR的原理01荧光定量PCR的标记方法02荧光定量PCR解析方法03SYBR法实验流程及注意事项04TIANGEN公司荧光定量产品选择指南05内容概要12利用荧光信号的变化实时检