DB21T 2357-2014 A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法　.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2357—2014

A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法

RT-PCRassayforFoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAnucleicacid

2014-07-29发布2014-09-29实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2357—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：顾贵波、王宏燕、曹东、薛树山、杨作丰、石霖、杨本勇、李红魁、王克才、吴运谱、郑洪玲、闫海滨、马永春、王国庆

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DB21/T2357—2014

A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了A型口蹄疫病毒（FMDV-A）RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准规定的RT-PCR方法适用于检测偶蹄动物的水疱皮、水疱液、淋巴结、脊髓等组织样品及食道-咽部分泌物（O-P液）。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

分析实验室用水规格和试验方法口蹄疫诊断技术规范

兽医实验室生物安全技术管理规范

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

FMDV-A（Foot-and-mouthdiseasevirusserotypeA）

A型口蹄疫

O-P（Oesophagus-pharyngeal）

食道-咽部分泌物

DEPC（Diethypyrocarbonate）

焦炭酸二乙酯

EDTA（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）

乙二胺四乙酸

dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)

脱氧核苷酸三磷酸

EB（Ethidiumbromide）

溴化乙锭

TAE（Tris/Acetate/EDTA）

TAE缓冲液

PBS（PhosphateBufferedSaline）

磷酸盐缓冲液

RNA(Ribonucleicacid)

核糖核酸

DNA（Deoxyribonucleicacid）

脱氧核糖核酸

cDNA（complementarydeoxyribonucleicacid）

互补脱氧核糖核酸

RT-PCR（Reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）

反转录-聚合酶链式反应

PCR（PolymeraseChainReaction）

聚合酶链式反应

TaqDNApolymerase

TaqDNA聚合酶

4原理

FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-A保守基因序列设计一对引物，在TaqDNApolymerase催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

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5实验器材

眼科剪、眼科镊、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、500mL量筒、500mL三角瓶、吸头、分析天平、台式低温高速离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、冰箱、微波炉、组织研磨器、微量移液器。

6试剂

6.1TRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。

6.2氯仿、异丙醇、无水乙醇。

6.31%琼脂糖凝胶（见附录A中A.1）。

6.4溴化乙锭（EB，10μg/μL）溶液（见附录A中A.2）。

6.550×TAE电泳缓冲液（见附录A中A.3）。

6.6焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水（DEPC水）（见附录A中A.4）。

6.7DNA分子量标准(DL2000Marker)。

6.875%乙醇（用DEPC水配制）（见附录A中A.5）。

6.9上样缓冲液。

6.101×TAE电泳缓冲液。

6.11磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L、pH7.2）（见附录A中A.6）。

6.1250%甘油磷酸盐缓冲液（见附录A中A.7）。

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