NR4A1通过PI3K_AKT信号通路调控C2C12细胞糖代谢的机制研究.pdfVIP

NR4A1通过PI3K/AKT信号通路调控C2C12细胞糖代谢的机制研究

摘要

目的：糖尿病（DM）是一种由胰岛素相对或绝对缺乏、靶细胞对胰岛素的敏

感性降低以及糖脂和蛋白质代谢紊乱引起的代谢性疾病。骨骼肌是人体内葡萄糖代

谢的主要器官，在对抗胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2DM）中至关重要。在

骨骼肌中，胰岛素刺激可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通

路，在葡萄糖转运的调控中发挥重要作用。骨骼肌中最主要的葡萄糖转运体为葡萄

糖转运蛋白-4（GLUT-4），其功能受PI3K/AKT这一经典通路调节。核受体亚家族

4A组成员1（NR4A1）是一种孤核受体，广泛参与机体葡萄糖和脂质代谢等多种

功能的调节。NR4A1与PI3K/AKT信号通路在糖代谢中均发挥重要的作用。本研究

使用毒胡萝卜素（TG）处理C2C12细胞损害细胞糖代谢，探究NR4A1在C2C12细

胞糖代谢中的作用，及其与PI3K/AKT信号通路的关联。

研究方法：

第一部分：（1）分化培养基诱导C2C12细胞分化，qPCR法检测各时间点细胞

生成素（MyoG）及成肌分化抗原（MyoD）mRNA水平。（2）将分化后的C2C12

细胞分为NC组、INS组，饥饿处理6h，加入胰岛素使INS组胰岛素终浓度为20

nmol/L，10min后收取细胞。Westernblot法检测处理后C2C12细胞p-PI3K、p-AKT

蛋白表达水平。（3）梯度浓度TG处理分化后C2C12细胞24h，CCK-8法检测细胞

存活率，筛选适宜TG浓度。（4）分化的C2C12细胞分为NC组、EtOH组、TG组。

NC组为空白对照，无特殊处理；TG组使用TG处理，浓度为1μmol/L，EtOH组加

入与毒胡萝卜素体积相同的无水乙醇，等待18h，饥饿处理6h，加入胰岛素使胰

岛素终浓度为20nmol/L，10min后收取细胞。使用葡萄糖检测试剂盒检测处理后

培养基葡萄糖消耗水平，Westernblot法检测C2C12细胞NR4A1、p-PI3K、p-AKT

蛋白表达水平。

第二部分：（1）使用过表达NR4A1及空载慢病毒感染C2C12细胞，获得过表

达NR4A1及空载对照的C2C12细胞，分别标记为NC、OV细胞。NR4A1-siRNA、

NC-siRNA转染分化的C2C12细胞，获得敲低NR4A1及空载对照的C2C12细胞，

分别标记为si-NR4A1、si-NC细胞。Westernblot法验证转染、感染效率。（2）将感

染慢病毒后的细胞分为NC组、OV组、NC+TG组、OV+TG组，转染后的细胞分

为si-NC组、si-NC+TG组、si-NR4A1+TG组。NC组、OV组、si-NC组加入与TG

等体积的无水乙醇，NC+TG组、OV+TG组、si-NC+TG组、si-NR4A1+TG组加入

1μmol/LTG，18h后弃原培养基，使用无血清培养基处理6h，最后加入20nmol/L

胰岛素刺激10min。葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖消耗水平，Westernblot法检测

NR4A1、p-PI3K、p-AKT、GLUT-4蛋白表达水平。

结果：

第一部分：（1）分化至第4天起镜下可见明显的肌管。qPCR结果显示，分化

标志物MyoD、MyoG随分化时间延长表达逐渐增加（P＜0.05）。（2）C2C12细胞

p-PI3K、p-AKT表达水平在胰岛素刺激后显著增高（P＜0.05）。（3）CCK-8检测结

果显示，当TG浓度为0、0.2、0.5、1μmol/L时细胞存活率无明显降低（P＞0.05），

TG浓度大于1μmol/L时，细胞存活率随TG浓度增加而减少（P＜0.05）。（4）EtOH

组葡萄糖消耗、NR4A1、p-PI3K、p-AKT表达水平与NC组未见明显差异（P＞

0.05）。TG组葡萄糖消耗较NC组明显下降，NR4A1、p-PI3K、p-AKT表达水平显

著下调（P＜0.05）。

第二部分：（1）Westernblot结果显示，与