膜片钳实验与技术.pptVIP

处理微电极拉制成功后，其尖端需进一步处理。这一过程包括涂硅酮树酯（sylgardcoating）和热抛光（heatpolish）。前者是将硅酮树酯涂于微电极尖端以外部分，达到使浸入浴液中的微电极表面呈疏水性，减小电极内部与溶液之间的电容。热抛光是在显微镜下，将微电极尖端接近热源（通电加热的铂丝或白金丝等），使电极尖端表面变得更加宽阔和光滑，经热抛光处理的微电极可使高阻封接的成功率明显提高。12充灌微电极使用前要充灌电极内液，电极内液需经0.2μm的滤膜或滤纸过滤。充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。也应避免充灌电极内液太多，否则影响实验噪声基线。除脑片膜片钳和盲膜片钳法之外，实验所需标本均为具有生物活性的离体细胞，其来源包括急性分离、原代和传代培养的细胞。从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固程度不同，采用的分离方法也不完全相同。大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及清洗等步骤。高阻封接形成与否是记录细胞离子通道电流能否成功的前提，是进行膜片钳实验的关键一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程，可以采用软件或刺激器发出1mV脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过示波器或显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显示器或示波器上可见一直线。1进行高阻封接时，需注意的是：2在微电极未入液之前常施以正压，防止浴液表面灰尘或溶液中粒子附着于电极尖端，影响高阻封接。3电极尖端与细胞膜接触，稍加负压后电流波形变得平坦，此时，如使电极超极化，则有助于加速形成高阻封接。4电极入液后封接的成功率与入浴液后的时间呈反比，电极内液中的肽类或蛋白质成分也会有碍于封接形成。离子通道电流的记录离子单通道电流的记录是膜片钳技术的最大优势，当尖端直径为1μm的玻璃微电极与细胞膜形成高阻封接后，根据单通道电流的特征，很容易得到对某种离子有选择性通透的单一的离子通道电流。由于单通道电流大小仅为1pA（10-12A）左右，要记录到这一微小电流，除尽量降低膜片钳系统噪声及电极噪声外，良好的高阻封接是获得低噪声记录的先决条件。全细胞电流记录全细胞记录是膜片钳四种基本模式之一。尽管它记录的是细胞膜多个离子通道开放产生的宏膜电流，但由于该模式既可以对离子通道的性质和分类进行宏观性质的分析，也可以对离子通道的构造、分布与功能进行微观性质的分析，从而使其成为当前电生理研究中应用最广泛的一种模式。全细胞记录模式可用于测定在某个时间和电压情况下，离子通道电流的大小，观察其电压依赖性特征，如以膜电位为横座标，电流强度为纵座标，则可绘制出电流-电压关系曲线（I-V曲线）。在电流为零时的膜电位被称为反转电位。I-V曲线和反转电位反映了某种通道的电压依赖性及药物等因素对通道电压依赖性的影响，常作为全细胞记录模式结果分析的指标之一。由α1γα2βδ五个亚基组成，呈五边形排列。每个亚基有4个跨膜区段即M1~4，由五个亚基的M2共同构成孔道的内壁。在α1和α2亚基N端的细胞外部分各有一个ACh结合位点，当两个ACh分子与α亚基结合后，便引起通道蛋白的构象变化和通道开放，主要引起Na+内流增多。三、离子通道的分类非门控离子通道01门控离子通道02电压门控性通道03化学门控性通道04机械门控性通道05有些离子通道始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号的明显影响，这些通道称为非门控离子通道。如神经和肌肉细胞静息电位就是由于细胞膜上的离子通道允许K+自由进出细胞，而引起的K+电化学平衡电位，此种K+通道即属于非门控性离子通道。电压门控离子通道（voltage-gatedionchannels）又称电压依赖性离子通道，这一类通道的开启或关闭受膜电位的变化决定，具有电压依赖性和时间依赖性。电压门控离子通道一般以最容易通过的离子命名，如钠离子通道、钙离子通道及钾离子通道等。钠离子通道（sodiumchannels，简称钠通道），是选择性地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）和μ-食鱼螺毒素（μ-conotoxin,μ-CTX）的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。钙离子通道（calciumchannels，简称钙通道）是选择性容许Ca2+跨膜通过的离子通道。根据肌细胞和神经元电压门控离子通道对膜电位变化的敏感性，将神经元质膜电压门