细菌革兰氏染色法标准流程.pdf

细菌革兰氏染色法

1.目的

为镜检细菌形态结构提供样本

2.范围

适用于实验室常见细菌的抹片制备及染色

3.采样对接人

服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。

4.设备和材料

无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、

三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、

营养琼脂培养基、5％石炭酸液；；碘片；碘化钾；95％酒精；

碱性复红粉末；显微镜；试管架；酒精灯；接种环；药匙；称量

纸；电子称；待试菌；灭菌蒸馏水；吸水纸；香柏油；灭菌玻片、

100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、打火机、擦镜纸、

计时器

5、采样及送样操作

采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目的进行采样→保证组织

完整性→独立存放到封口袋中并做好标记。

运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，

不可冷冻。

样品的标识

要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果

抽样日期及周龄、检测项目等内容。

6、细菌分离

在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）

用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上

（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒

温培养箱中培养18-24h后备用。

7、操作步骤

7.1细菌抹片的制备

1、玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，

能均匀展开，附着性好。如有残余油迹，可按下列方法处理：

2、滴上95％酒精2～3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯

上轻轻脱过几次。

3、若上述方法未能去除油渍可再滴1～2滴冰醋酸，用纱布擦

净，再在酒精灯上轻轻通过。

4、抹片：所用材料不同，抹片方法亦有差异

5、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳液）可直接用

灭菌接种环取一环材料与玻片的中央均匀涂成适当大小的薄层。

6、不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环

取少量生理盐水或蒸馏水，置与玻片中央，然后再用灭菌接种环取

少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

7、组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀

取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印或涂成一薄片。

8、如有多个样品同时须要制成抹片，只要染色方法相同，亦可

以在同一张玻片上有序的排好，做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片

上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留的样本片，

应贴好标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等

9、上述涂片应让其自然干燥。

10、固定：有两类固定方法

火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒

精灯上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为

度）进行固定。

化学固定：血液、组织、脏器等抹片要作吉姆萨染色时，不

用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片侵入甲醇中

2～3分钟，取出晾干：或在玻片上滴加数滴甲醇使其作用2～3分

钟后，自然挥发干燥，抹片如作瑞氏染色，则不必先作固定。染料

中含有甲醇，可以达到固定的目的。

7.2染色具体操作：

1.涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用

接种环以无菌操作分别从培养好的菌落（不同菌培养时间不同）斜

面上挑取少量菌于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；

滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚

2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒

精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过

长，以防标本烤枯而变形或者室温自然干燥。

3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，

在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以

载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待

冷后，进行染色。

4初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆

盖涂片，染色约1min，

5水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至

洗下的水呈无色为止。

6媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300u