蛋白质结构分析.ppt

四、蛋白质高级结构的实验解析方法蛋白质结构实验分析主要有三大技术平台（一）X-衍射蛋白质晶体结构分析（二）核磁共振波谱分析（三）冷冻电镜技术第31页，共83页，星期日，2025年，2月5日（一）蛋白质晶体结构X-衍射分析摸索蛋白质结晶条件、快速处理晶体结构数据和减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题或瓶颈。是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整合、模型加工和确认。晶体结构分析的常用软件有SOLVE，RESOLVE等。第32页，共83页，星期日，2025年，2月5日（二）核磁共振波谱分析利用核磁共振原理，检测分子质量小于60kμ的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后采集各种不同的峰组成图谱，并利用生物信息学方法筛选出具有特定结构特征的图谱。常用NMRPipe和SPARKY软件处理这些过程，使用XEASY，DYANA和GARANT等软件分析侧链或骨架结构。第33页，共83页，星期日，2025年，2月5日与X-衍射晶体分析技术相比较，NMR技术在蛋白质结构测定的速度上、和研究的对象上都存在一定的限制，成本太高，步骤繁多。但其无需制备晶体标本，可在溶液中直接测定，也可进行固相测定，因此利用NMR法使得某些无法获得晶体结构的蛋白质或非液相蛋白质（如膜蛋白）的结构测定成为可能。相对而言，NMR技术更适合小分子质量以及水溶性较好培养晶体困难的蛋白质结构的分析，对于蛋白质折叠、局部动力学或构象分析、蛋白-蛋白相互作用，NMR更体现其优越性。X-衍射晶体分析技术和NMR技术的比较第34页，共83页，星期日，2025年，2月5日（三）冷冻电子显微镜技术采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃态的水环境中，使我们能够观察到生物大分子在天然状态下的结构；同时冷冻的速度极快，把细胞在其生理活动的某些特定时刻固定下来，显示此时的结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构象变化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析，并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分子的结构，在此基础上观察多种成分的图像变化，追踪生物大分子的装配及其动力学过程。第35页，共83页，星期日，2025年，2月5日由冷冻电镜技术所获得的蛋白质三维结构与X射线晶体技术非常相似，而且其信噪比非常低，并适合于内在膜蛋白的分析。其独特优势为：可以用不同的方法对均一的（如膜蛋白的二维晶体，二十面体对称的病毒等对称结构）和不均一的（如核糖体等）样品进行三维结构重构，同时，冷冻电子显微镜是唯一的能研究小到蛋白质、蛋白质复合物，大到细胞器甚至整个细胞的方法。冷冻电子显微镜技术与X衍射晶体结构分析方法比较第36页，共83页，星期日，2025年，2月5日五、蛋白质结构的可视化可视化分析蛋白质的高级结构，有利于从原子间相互作用的层次理解生命活动过程的信息控制机制，更加有效地揭示分子在完成其功能过程中的演化情况，了解蛋白质分子结构和各种微观性质与宏观性质之间的定量关系。只要安装蛋白质分子图形学软件，并获得所需蛋白质结构数据，配以商业软件或免费的小分子图形设计系统，就可开展结构生物信息学的探索性工作。第37页，共83页，星期日，2025年，2月5日蛋白质可视化免费软件PymolPymol是强大的分子图形显示和基本特征测定系统Pymol可在/寻找链接下载，Pymol启动后显示双界面，对分子操作的常用命令界面，多种分析功能界面。第38页，共83页，星期日，2025年，2月5日1.图形界面左上侧列出主要的可操作对象并分成几个层次，包括所选对象、蛋白质、整体等；2.每个层次的对象有五种主要操作：动作(A:action)、显示(S:Show)、隐藏(H:hide)、标记(L:Label)、上色(C:Color)。3.Dispaly下拉菜单中可显示蛋白质中每条肽链的序列和非蛋白质成分，鼠标左键单击序列选中特殊待操作的残基可同时显示对象所在位置；还可设置背景(论文中这类图一般用白色背景，而报告中常用黑色背景以增加视觉效果)；4.Wizard中有对分子常用性质测定模块，包括距离、电荷等以及尝试进行蛋白质分子改造的功能。蛋白质图形操作和性质测定第39页，共83页，星期日，2025年，2月5日第三节蛋白质结构数据库ProteinStructureDatabases一、蛋白质三维结构数据库