核算杂交技术聚合酶链反应.ppt

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束第63页，共98页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第64页，共98页，星期日，2025年，2月5日PCR的技术路线第65页，共98页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本步骤体系（加样方法）10×PCR缓冲液10ulDNA模板0.1-1ugdNTP（2mmol/L）各10ul两种引物（10-50umol/L）各1-2ulddH2O（灭菌）加至100ul离心15s，加石蜡第66页，共98页，星期日，2025年，2月5日PCR的基本步骤PCR循环预变性97℃，2-5min，迅速冷却至室温加入TaqDNA聚合酶主循环变性94℃30-60s退火55℃30-60s延伸72℃60-150s循环25-35次终延伸72℃5-10min第67页，共98页，星期日，2025年，2月5日第68页，共98页，星期日，2025年，2月5日PCR的反应体系及其优化第69页，共98页，星期日，2025年，2月5日概述模板引物缓冲体系一价或二价阳离子四种dNTP耐热DNA聚合酶第70页，共98页，星期日，2025年，2月5日取出尼龙膜，甩掉多余液体，将有RNA的一面朝上，在滤纸上晾几分钟。将尼龙膜晾干后，夹在两滤纸之间，在真空烘烤箱中80℃烘烤2h。第31页，共98页，星期日，2025年，2月5日杂交将放射性同位素标记的DNA探针经100℃煮沸5min和冰浴2min变性，然后将探针和膜放入袋中杂交，在68℃水浴中杂交过夜。第32页，共98页，星期日，2025年，2月5日杂交结束后，将尼龙膜在一定量的0.1%SDS-1倍SSC中室温下轻轻摇动洗涤10min，然后在一定量的预热至68℃的0.1%SDS-0.5倍SSC中洗涤3次。第33页，共98页，星期日，2025年，2月5日注意事项：1、EB会影响RNA与尼龙膜的结合，所以在胶中不能加核酸染料EB。2、实验所用的器具、试剂以及实验环境一定要防止RNase的污染。3、所有用于Noethern印迹的溶液均需用DEPC处理后高压消毒的高质量去离子水制备。4、操作人员必须戴防护手套和口罩，防止RNase污染和操作人员吸入DEPC中毒。第34页，共98页，星期日，2025年，2月5日聚合酶链反应第35页，共98页，星期日，2025年，2月5日基因扩增（geneamplification)——指生物体内或体外基因拷贝数大规模增加。PCR扩增：应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。基因扩增技术---PCR第36页，共98页，星期日，2025年，2月5日DNA的复制（1）3’-OH进攻5’-?PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘-3’第37页，共98页，星期日，2025年，2月5日DNA的复制（2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA第38页，共98页，星期日，2025年，2月5日DNA的复制（3）第39页，共98页，星期日，2025年，2月5日PCR技术的创建

KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第40页，共98页，星期日，2025年，2月5日故事发生在1983年

的春夏之交第41页，共98页，星期日，2025年，2月5日KaryB.Mullis(1