第4章 蛋白质的理化性质、分类及研究方法.ppt

（三）根据电荷性质的差异1.电泳法电泳：在电场的作用下，带电荷的蛋白质或核酸分子将向与其电荷符号相反的电极方向移动的现象称为电泳。意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和分子量的测定。电泳仪水平电泳槽垂直电泳槽SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方法。聚丙烯酰胺凝胶由单体—丙烯酰胺和交联剂—甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。网状的大小决定于丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。SDS(sodiumdodecylsulfate)SDS是一种阴离子表面活性剂，几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚；SDS带有很多负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，所以在同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白质移动速度的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。十二烷基硫酸钠不连续：浓缩胶和分离胶浓缩胶分离胶PAGE垂直平板电泳示意图1.加入Seperatinggel约2／32.立即加入蒸餾水2ml以压平胶体蒸餾水Separatinggel分离胶的制备SeparatinggelStackinggelcomb1.加入stackinggel2.插入comb注意：浓缩胶要加满插入comb時要注意避免有气泡浓缩胶的制备SeparatinggelStackinggel–＋垂直電泳Bufferdye加样2.等电聚焦（1）基本原理根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。（2）优点及主要用途加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快，分离的蛋白质不变性。可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定。等电聚焦电泳电泳时，每种蛋白迁移至与它的pI相一致的pH处加入蛋白样品电场作用下在凝胶中建立稳定的一个pH梯度等电聚焦的运作机制：-+pH357911++++++-------+--+++---++++--+++----+++--3.离子交换层析法基本原理：利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖层析载体由基质和带电基团组成层析载体的种类：①阳离子交换剂（带负电）如：磺丙基（强酸型）SP-Sephadex-O-(CH2)3-SO3H②阴离子交换剂（带正电）如：二乙基氨基乙基（中强碱型）（四）亲和层析亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。（五）高效液相层析（HPLC）HPLC纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规模（数毫克到数十毫克）Waters公司的HPLC已备有大规模制备的层析柱。将亲和层析的高分辨力和HPLC的快速结合。高效液相层析仪典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用高压泵输入。1.凝胶过滤法测定蛋白质分子量依靠分子筛效应分离蛋白质，该方法适应球状蛋白的测定。五、蛋白质相对分子质量的测定蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。因此用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形）分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。1）测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕2）以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线。3）再测出未知