第四章基因克隆的质粒载体.pptVIP

（三）、质粒载体的构建与类型1.天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。第62页，共119页，星期日，2025年，2月5日第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR?酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr），插入外源片段后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。第63页，共119页，星期日，2025年，2月5日ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片段后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。第64页，共119页，星期日，2025年，2月5日2.理想的质粒载体必须具备的基本条件(1)具有复制起点自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。(2)具有抗菌素抗性理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。(3)具有若干限制酶切单一位点（MCS）(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数，可获得大量的克隆基因。第65页，共119页，星期日，2025年，2月5日以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）第66页，共119页，星期日，2025年，2月5日3.质粒载体的选择记号新陈代谢特性；对大肠杆菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。第67页，共119页，星期日，2025年，2月5日二、质粒载体的选择标记抗菌素名称作用方式抗性机理氨苄青霉素干扰细菌胞壁的合成产生β-内酰胺酶，破坏β-内酰胺环。氯霉素作用50S亚基，干扰蛋白合成。产生乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化失活。卡那霉素作用70S亚基，导致mRNA错读。产生的氨基糖苷磷酸转移酶，修饰卡那霉素。链霉素作用30S亚基，导致mRNA错译。产生的特殊酶，修饰链霉素。四环素作用30S亚基，干扰蛋白合成。产生的蛋白质对细菌的膜修饰，阻止四环素进入菌内。第68页，共119页，星期日，2025年，2月5日4.不同类型的质粒载体（1）高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因（2）低拷贝的质粒载体有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。第69页，共119页，星期日，2025年，2月5日(3)失控的质粒载体复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。Example：pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2~3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。第70页，共119页，星期日，2025年，2月5日(4)插入失活型质粒载体将外源DNA片段插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example：在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片段，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片段的重组体质粒的几率会显著上升。第71页，共119页，星期日，2025年，2月5日(5)正