蛋白质的提取.pptVIP

由于蛋白质的分子量很大，它在水中可以形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的经典性质，如丁达尔现象、布郎运动等。

由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。;蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。

变化溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质

在合适的条件下，蛋白质可以从溶液中沉淀出来。;在温和条件下，通过变化溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。

在沉淀过程中，构造和性质都没有发生变化，在合适的条件下，可以重新溶解形成溶液，因此这种沉淀又称为非变性沉淀。

可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本措施，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。;在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，并且也破坏了蛋白质的构造和性质，产生的蛋白质沉淀不也许再重新溶解于水。

由于沉淀过程发生了蛋白质的构造和性质的变化，因此又称为变性沉淀。

如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。;蛋白质的性质与它们的构造亲密有关。某些物理或化学原因，可以破坏蛋白质的构造状态，引起蛋白质理化性质变化并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。;蛋白质的变性;大部分蛋白质均具有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸取。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸取。

运用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。;要研究某种蛋白质的构造、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白质的分离与纯化技术便成为蛋白质研究的重要技术。;研究蛋白质的构造、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。

(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；

(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。

(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。;(1)生物组织的机械破碎。常用的措施有研磨法、超声波法和酶解法等。

(2)根据蛋白质的特性，选择不一样的溶剂进行抽提。

水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液???抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。

(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。

(4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。

(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。;血红蛋白提取和分离环节;

血

液;1.洗涤红细胞;2.血红蛋白的释放;3.分离血红蛋白溶液;;★注意事项★;离心沉降法

凝胶色谱法

萃取法

层析法

电泳法;1.凝胶色谱法;;;1）原理：;2）电泳成果分析

假如出现一种条带：样品中具有一种分子质量级别多肽；

假如出现两个条带：样品中具有两个分子质量级别多肽。

;由弱酸和对应的强碱弱酸盐溶解于水中。

如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等;试验四血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳;【试验原理】

;V=EQ/(6πrη);【试验原理】

;影响蛋白质分子运动速度的原因;3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的构造，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、迅速、简便、辨别力高，对样品无拖尾和吸附现象等长处;血清蛋白参照值;4.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。;【试验器材】;【试验试剂】;

1.浸泡

将2×8cm醋酸纤维薄膜置于电泳缓冲液中，浸泡15min左右，至完全浸透，方可用于点样。

;2.点样

用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多出的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整洁的玻片沾取少许无溶血血清，垂直按压于醋纤膜标号一端约1.5-2㎝处(约2～3μl);3.电泳

将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。规定薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。

平衡半晌(2-3min)；使其自然充斥缓冲液；而后电压120V，电流0.4～0.6mA/㎝，通电45分钟。;4.染色：

电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡3-5min

;5.漂洗：

将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗多次(3-4次)，直至条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱。;6.记录和分析试验成果

漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸