DB65 应用母体外周血中游离DNA 鉴定绵羊早期胎儿性别技术规程.docxVIP

ICS65.020.30B43

新疆维吾尔自治区地方标准

DB65/T4093—2018

应用母体外周血中游离DNA鉴定绵羊早期胎儿性别技术规程

Technicalspecificationofidentifyingthesheepsearlyfetalsexbyapplyingfree

DNAfrommaternalperipheralblood

2018-1-25发布2018-2-25实施

新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布

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DB65/T4093—2018

前言

本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编写。

本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅提出。

本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。

本标准由新疆畜牧科学院畜牧研究所和新疆农业大学负责起草。

本标准主要起草人：田可川、黄锡霞、赵冰茹、何军敏、吴伟伟、田月珍、王旭光、徐新明、付雪峰、哈尼克孜·吐拉甫、阿布来提·苏来曼、陈华峰、朱桦、曾伟丹。

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应用母体外周血中游离DNA鉴定绵羊早期胎儿性别技术规程

1范围

本标准规定了应用母体外周血游离DNA鉴定细毛羊胎儿性别技术要点及其操作规范。

本标准适用于应用母体外周血游离DNA鉴定细毛羊胎儿性别。

2术语及定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

外周血中游离DNAFreeDNAinperipheralblood

外周血中游离的DNA主要是指存在于血浆及血清等循环系统里的一些小片段DNA。2.2

性别鉴定Genderidentification

在胎儿出生前，利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，借助DNA染色体检测技术，结合荧光定量PCR技术，检测母血中是否含有胎儿Y染色体，以确定胎儿性别。

2.3

SRY基因SRYgene

雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。

2.4

巢式PCR反应NestedPCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR),使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(第一次PCR扩增片段内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

2.5

PCR扩增PolymeraseChainReaction

聚合酶链式反应简称PCR(PolymeraseChainReaction),又称：多聚酶链式反应。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

3材料与方法

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3.1材料

选取妊娠时期3周～10周的绵羊。每只绵羊颈静脉采血量为3mL~5mL,EDTA或肝素钠(1%)等抗凝，采血后，颠倒混匀防止血液凝固；非抗凝管采血量为3mL~5mL;并于采血后2h内进行血浆和血清的分离，冷冻保存。抽取1例健康公羊血液作为阳性对照，抽取1例未孕母羊血液作为阴性对照。

3.2药品

a)β-actin基因、

b)绵羊SRY基因引物(绵羊SRY基因巢式内外引物利用Primer5.0软件自行设计，交由生物公司合成)

c)TaqDNA聚合酶

d)饱和酚

e)抗凝剂ACD

f)Tris-HCl

g)10%SDS

h)氯仿

i)异戊醇等

3.3仪器设备

a)Eppendorf移液器

b)Cycler型PCR仪

c)凝胶琼脂糖电泳仪

d)小型离心机

e)凝胶成像仪

f)制冰机

3.4方法

3.4.1血浆样品的制备

取EDTA抗凝血3mL置于离心管，3000rpm离心15min,移取上层血浆到另一洁净的1.5mL离心管中，重复1次后，-20℃保存备用。

3.4.2血清样品的制备

取非抗凝处理血样室温静置150min左右，1500rpm离心15min后收集上层血清，-20℃保存备用。

3.4.3游离胎儿DNA提取