炭黑与CTNNB1竞争性结合ΔNp63致气道上皮损伤修复异常的机制研究.pdfVIP

炭黑与CTNNB1竞争性结合ΔNp63致气道上皮损伤

修复异常的机制研究

摘要

背景与目的

炭黑（Carbonblack，CB）纳米颗粒是一种广泛应用的工业材料，随着CB的

大规模生产，人们在职业环境中接触CB的风险正在增加。CB进入人体后会诱发呼

吸道疾病和肺部损伤。气道上皮细胞是抵御污染物进入人体的重要物理屏障，因其

持续暴露于环境中而极易受到损伤，损伤后的高效修复对于维持上皮稳态和预防疾

病至关重要。研究发现CB会抑制气道上皮细胞增殖。然而，气道上皮细胞修复过

程主要包括细胞增殖和分化两个阶段，目前对CB暴露干扰气道上皮细胞修复的关

键阶段尚未完全阐明。本研究旨在评估CB暴露干扰气道上皮细胞修复的关键阶段，

揭示CB致气道上皮细胞修复异常的毒理学机制。

方法

1.在气道上皮细胞增殖、分化过程中及整个修复周期给予CB暴露，通过实时

荧光定量PCR（Quantitativereal-timePCR，qRT-PCR）检测修复生物标志物粘蛋白

5B（Mucin5B，MUC5B）、粘蛋白5AC（Mucin5AC，MUC5AC）、叉头框蛋白J1

（Forkhead-boxJ1，FOXJ1）、叉头框蛋白J2（Forkhead-boxJ2，FOXJ2）的mRNA

表达，阐明CB暴露对气道上皮细胞修复的干扰效应；并记录修复过程中原代人支

气管上皮细胞（Primaryhumanairwayepithelialcells，pHAECs）的跨膜电阻值

（Transepithelialelectricalresistance，TEER），以评估CB作用下气道上皮细胞屏障

完整性的变化。之后，通过EdU增殖实验检测细胞增殖数量变化、qRT-PCR检测增

殖生物标志物细胞周期调节蛋白-67（Cellcycleregulatoryprotein-67，Ki67）、增殖

细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的mRNA表达明确增殖阶段

是CB干扰气道上皮细胞修复的关键阶段。

2.将经ΔNp63过表达质粒处理的气道上皮细胞暴露于CB，通过EdU增殖实验

阐明ΔNp63对CB干扰气道上皮细胞增殖的介导效应。进而通过qRT-PCR和蛋白免

疫印迹（Westernblotting，WB）检测CB暴露对ΔNp63的mRNA和蛋白表达的影

响。

3.利用GTRD、ChIP-Atlas和KnockTF数据库预测受ΔNp63调控的相关靶基

因。将siRNA/ΔNp63-over质粒转染细胞后探讨ΔNp63对其靶基因CTNNB1的调控

作用。

I

4.使用JASPAR数据库预测ΔNp63在CTNNB1启动子区域内的结合位点，并经

分子动力学模拟（Moleculardynamics，MD）对CB、ΔNp63和CTNNB1之间的结

合和相互作用进行模拟分析。

结果

1.气道上皮修复过程中，在增殖阶段暴露CB，使MUC5B和FOXJ1的mRNA

表达水平显著下降，说明增殖阶段暴露CB会抑制杯状细胞和纤毛细胞生长；此外，

CB处理下，增殖生物标志物Ki67、PCNA的mRNA表达和EdU标记的增殖细胞数

量显著下调，明确了CB暴露对气道上皮细胞增殖的干扰效应。

2.气道上皮细胞中ΔNp63是p63的主要表达亚型。暴露CB显著降低ΔNp63的

mRNA和蛋白表达水平；并且过表达ΔNp63后，缓解了CB暴露对气道上皮细胞增

殖的抑制效应，证明ΔNp63在CB暴露诱导的细胞增殖抑制过程中发挥了重要调控

作用。

3.通过GTRD、Chip-Atlas和KnockTF数据库分析并结合文献查阅预测ΔNp63

的下游靶基因为表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR）、锯

齿状典型Notch配体1（JaggedcanonicalNotchligand1