基于蛋白拆分策略的Cre_loxP系统构建及其在烟草发根中的删除活性验证研究.docxVIP

基于蛋白拆分策略的Cre/loxP系统构建及其在烟草发根中的删除活性验证研究

1.引言

1.1研究背景

自1983年首例转基因植物诞生以来，植物转基因技术取得了长足的进步。该技术通过基因工程手段，将外源基因导入植物细胞中，使其表达出新的性状，从而改善植物的品质、增加产量或赋予其新的功能。目前，全球转基因作物的种植面积已经超过1.8亿公顷，主要集中在玉米、大豆、棉花和油菜等作物上。转基因技术在这些作物中主要应用于抗虫、抗除草剂、品质改良和抗病等方面。例如，通过转入Bt基因，植物能够产生毒蛋白，杀死害虫；转入抗除草剂基因后，作物可以在使用除草剂的情况下存活。

然而，随着转基因技术的广泛应用，转基因生物的安全性问题也日益受到关注。转基因生物可能会对人类健康和生态环境产生潜在风险，如转基因食品可能引发过敏反应、新型毒素或营养成分变化；转基因作物可能导致生物多样性下降，基因漂移可能影响野生植物基因等。因此，解决转基因生物的安全性问题成为了当前研究的热点之一。

位点特异性重组酶系统Cre/loxP在解决转基因生物安全问题方面具有重要的应用价值。Cre/loxP重组酶系统由Cre重组酶和loxP位点组成，Cre重组酶能够识别loxP位点，并在该位点处进行DNA重组，从而实现基因的删除、整合、倒置等操作。在转基因植物中，利用Cre/loxP系统可以删除筛选标记基因，降低转基因植物对环境和人类健康的潜在风险。然而，传统的Cre/loxP系统存在一些局限性，如Cre重组酶的持续表达可能导致不必要的基因重组，从而影响植物的正常生长发育。

蛋白拆分技术为解决传统Cre/loxP系统的局限性提供了新的思路。蛋白拆分技术是将蛋白质拆分成两个或多个片段，这些片段在特定条件下可以重新组合成具有活性的蛋白质。将蛋白拆分技术应用于Cre/loxP系统，可以实现Cre重组酶的可控表达，只有在特定条件下，拆分的Cre重组酶片段才会重新组合并发挥活性，从而提高转基因植物的安全性。

烟草作为一种模式植物，具有生长周期短、易于转化等优点，常被用于植物基因工程研究。在本研究中，选择烟草发根作为研究对象，旨在构建基于蛋白拆分的Cre/loxP系统，并对其在烟草发根中的删除活性进行初步验证，为解决转基因植物的生物安全性问题提供理论依据和技术支持。

1.2研究目的与意义

本研究旨在构建基于蛋白拆分的Cre/loxP系统，并验证其在烟草发根中的删除活性。通过本研究，期望能够实现对转基因烟草发根中外源基因的可控删除，为解决转基因植物生物安全性问题提供新的策略和方法。

从理论意义上看，本研究有助于深入理解蛋白拆分技术与Cre/loxP系统相结合的作用机制，丰富和拓展植物基因工程领域的理论知识。探究不同拆分位点和条件对Cre重组酶活性恢复及基因删除效率的影响，为进一步优化基因删除系统提供理论基础。在实践意义方面，若基于蛋白拆分的Cre/loxP系统在烟草发根中成功实现高效删除活性，将为转基因植物的商业化应用提供更安全可靠的技术手段。降低转基因植物中外源基因对环境和人类健康的潜在风险，有助于提高公众对转基因技术的接受度，推动转基因技术在农业生产中的广泛应用。该技术还可能为其他植物基因工程研究提供借鉴和参考，促进相关领域的技术发展。

1.3研究内容与技术路线

本研究的主要内容包括以下几个方面：首先是基于蛋白拆分的Cre/loxP系统的构建，分析Cre重组酶的结构与功能，确定合适的拆分位点；将拆分后的Cre重组酶片段与内含肽等元件进行融合，构建原核表达载体和植物表达载体。其次是对拆分蛋白进行体外活性检测，诱导表达并纯化拆分后的Cre重组酶蛋白；通过体外重组实验和酶活性检测，验证拆分蛋白在特定条件下能否恢复活性。再者是进行发根农杆菌介导的烟草遗传转化，将构建好的植物表达载体转化到发根农杆菌中；利用发根农杆菌介导法将外源基因导入烟草细胞，诱导产生转基因发根。然后对转基因发根中Cre/loxP系统的删除活性进行验证，通过GUS组织染色、分子检测等方法，分析转基因发根中目的基因的删除情况；统计删除效率，评估基于蛋白拆分的Cre/loxP系统在烟草发根中的删除效果。

本研究的技术路线如图1-1所示：

获取Cre重组酶基因序列，分析结构确定拆分位点，构建原核表达载体，进行蛋白诱导表达与纯化，体外活性检测。活性验证成功后，构建植物表达载体，转化发根农杆菌，侵染烟草外植体诱导发根。对转基因发根进行GUS染色、PCR、测序等分子检测，分析删除效应与效率。

[此处插入技术路线图，图名为“图1-1技术路线图”，图中清晰展示从获取基因序列到分析删除效率