羟基磷灰石材料与人脐血管内皮细胞相容性的初步实验研究.docxVIP

羟基磷灰石材料与人脐血管内皮细胞相容性的初步实验研究

一、引言

（一）研究背景与意义

在全球范围内，心血管疾病已成为威胁人类健康的主要杀手之一。据世界卫生组织（WHO）统计，心血管疾病每年导致的死亡人数占全球总死亡人数的30%以上，且这一数字仍呈上升趋势。我国心血管病患病率及死亡率同样处于上升阶段，推算心血管病现患人数达2.9亿，其中高血压患者约2.7亿，冠心病患者1100万。人工机械瓣膜置换术作为治疗心脏瓣膜病的重要手段，在临床上得到了广泛应用，为众多患者带来了生存的希望。

然而，人工机械瓣膜置换术后长期抗凝治疗引发的一系列并发症，严重影响了患者的生活质量和预后。长期使用抗凝药物会导致出血风险增加，如颅内出血、消化道出血等，这些出血事件往往具有较高的致死率和致残率。有研究表明，抗凝不当导致的颅内出血发生率约为1％/病人年，占自发性脑出血的10-12％，病死率可超过50％。同时，血栓形成也是一个常见问题，可能导致瓣膜功能障碍、栓塞等严重后果，进而影响心脏的正常功能，甚至危及生命。

寻找一种新型的机械瓣膜材料，以降低术后抗凝相关并发症的发生，成为心血管领域亟待解决的关键问题。羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）作为人体骨组织的主要无机成分，其化学结构与人体骨骼组织高度相似，具有良好的生物相容性，在骨组织工程领域已得到广泛应用，如用于人工关节置换、骨折治疗、修复骨组织等。HA可被人体内的细胞无害吞噬，逐渐地被骨组织取代，不仅不会引起异物反应以及局部或全身的毒性反应，还能促进骨再生。

鉴于HA在骨组织中的优异表现，其在心血管组织工程领域的潜在应用价值也开始受到关注。血管内皮细胞是心血管系统的重要组成部分，它不仅作为血液与组织之间的屏障，还参与了许多生理过程，如血管舒张、凝血调节、炎症反应等。探究HA材料与血管内皮细胞的相互作用，对于评估其作为组织工程化机械瓣膜材料的可行性具有重要意义。若HA材料能够与血管内皮细胞良好相容，促进内皮细胞的黏附、生长和增殖，那么它有望成为一种理想的机械瓣膜材料，为解决人工机械瓣膜置换术后的抗凝难题提供新的思路和方法。

（二）研究目的与目标

本研究旨在深入探究羟基磷灰石材料与人脐血管内皮细胞（HUVECs）的相容性，为其在组织工程化机械瓣膜中的应用提供坚实的实验依据。具体目标如下：

明确细胞相容性：通过体外实验，观察人脐血管内皮细胞在羟基磷灰石材料表面的黏附、生长和增殖情况，运用形态学观察、生长曲线测定、MTT比色法测定及蛋白含量测定等多种方法，全面评估HA材料对人脐血管内皮细胞及其细胞活性的影响，从而明确HA材料与人脐血管内皮细胞的细胞相容性。

评估血液相容性：将人脐静脉内皮细胞培养在羟基磷灰石材料上，开展血小板粘附实验、全血凝固实验和动态凝血实验，检测其血液相容性，判断HA材料是否能够减少血栓形成的风险，为其在心血管领域的应用提供血液学方面的依据。

验证安全性：综合细胞相容性和血液相容性的实验结果，验证羟基磷灰石材料作为组织工程化机械瓣膜材料的安全性，为其进一步的临床前研究和临床应用奠定基础。

二、材料与方法

（一）实验材料与细胞培养

材料制备：采用脉冲激光沉积技术（PulsedLaserDeposition，PLD）在钛合金基底上制备纳米羟基磷灰石薄膜。PLD技术是一种利用高能量脉冲激光束蒸发靶材，使靶材原子或分子在基底表面沉积形成薄膜的方法。在本实验中，选用钛合金作为基底，是因为其具有良好的机械性能和耐腐蚀性，在生物医学领域应用广泛，如常用于制造人工关节、牙种植体等。使用KrF准分子激光（波长248nm），在550℃-650℃的衬底温度下，以4-7J/cm2的能量密度进行沉积。通过精确控制激光的能量密度、脉冲频率、沉积时间以及衬底温度等参数，确保纳米羟基磷灰石薄膜能够均匀、稳定地沉积在钛合金基底表面。沉积完成后，运用扫描电镜（SEM）对薄膜的表面形貌进行观察，可清晰看到薄膜由部分烧结的纳米级晶粒组成，纳米晶粒的平均尺寸会随着膜厚的增加而显著增大，这表明薄膜的生长机制涉及纳米晶粒的聚结。同时，利用X射线衍射（XRD）对薄膜的晶体结构进行分析，精确探测涂层的结晶度，以确保薄膜的纯度和晶体结构符合预期，为后续实验提供可靠的材料基础。

细胞来源与培养：人脐血管内皮细胞（HUVECs）取自健康新生儿脐带，在无菌条件下迅速将脐带转移至实验室。采用胶原酶消化法进行细胞分离，具体操作如下：首先用PBS冲洗脐带，以去除表面的血液和杂质；然后将0.1%-0.2%的胶原酶溶液注入脐带静脉中，在37℃条件下消化30-40分钟，使内皮细胞从血管壁上分离下来；接着收集含有细胞的消化液，经