第十六章酶免疫技术08课件.pptVIP

固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测HBcAb2.竞争法检测HBeAb：先将HBeAb包被在固相载体上，形成固相抗体，同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，待测样本的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原HBeAg结合。加入酶标的特异抗体，再加入酶底物，则显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比。固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体EE底物E竞争法检测HBeAb(五)捕获法固相载体上连接的是IgM的第二抗体，先将标本中的IgM类抗体捕获，然后再分别加入特异抗原和酶标抗体（动物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特异抗原-酶标抗体的复合物，复合物含量与待测IgM成正相关。最后加入底物，依据显色程度来确定待测血清中IgM的含量。固相抗人lgM抗体E标本（含抗体）抗原底物EE捕获法检测lgM抗体在应用此法时需注意RF(IgM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(IgM类)既能与固相载体上的IgM第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体结合，从而导致假阳性结果。在应用此法时需注意RF(IgM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(IgM类)既能与固相载体上的IgM第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体结合，从而导致假阳性结果。此法在临床上常用于病原体急性感染的实验室诊断，如急性甲型肝炎时可检测病人血清中HAV_LgM,急性乙型肝炎是可检测抗HBc_LgM以及TORCH系列的LgM检测等。(六)双抗原夹心法将已知抗原包被在固相载体上，待测标本中的相应抗体可分别与固相抗原和酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原的复合物，加入底物后依据显色程度来确定待测抗体的含量。E固相抗原标本（含抗体）酶标抗原底物EE三、ELISA的关键技术（一）各种试剂的制备1．抗原和抗体2．包被与封闭包被(coating)是将抗原或抗体固定在固相载体上的过程。封闭(blocking)就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。3．酶标结合物的制备（二）最适工作浓度的选择各类血清抗原稀释度1：501：1001：2001：4001：800强阳性1.201.040.840.680.42弱阳性0.640.410.300.220.19阴性0.230.130.080.060.05稀释液0..080.020.020.020.04间接法测抗体中包被抗原最适工作浓度的选择（三）测定方法的标准化1．加样应力求准确，并注意不可产生气泡。2．温育注意反应的温度和时间应按规定的要求，整块反应板的温度应一致。3．洗涤洗涤有手工洗涤和洗板机洗涤两种方法，若用洗板机洗涤要适当增加洗涤次数。4．显色要控制好显色时间。四、评价与应用评价ELISA的方法具有高度的特异性和灵敏度，操作方便快速，试剂稳定，对环境无污染，仪器、设备要求简单，实验结果既可以用肉眼观察作定性分析，也可以用酶标仪进行定性、定量分析，已经成为临床免疫检验中的常用技术。人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社第十六章酶免疫技术1.酶联免疫吸附试验的原理、方法类型、应用及注意事项。2.酶免疫分析技术的分类。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技术的基本原理及应用。本章要点间距大点目录酶标志物的制备1酶联免疫吸附试验2其他酶免疫技术3前言酶免疫分析技术是以酶标记抗原或抗体为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原。将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相结合的一种免疫检测技术。酶免疫技术酶免疫组化:主要对组织切片或其他标本中的抗原进行定位分析酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定第一节酶标志物的制备一、常用的酶和底物标记酶的条件：1.催化活性高，催化专一性强2.与抗原（抗体）偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性3.催化反应的结果易于判定或测量4.测定方法简便易行、敏感、精确5.催化的底物易于配制、保存6.酶、辅助因子和底物对人体无害且价廉易得1.辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值越大纯度越高RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供