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纳豆激酶FU测定方法.docVIP

纳豆激酶FU测定方法.doc

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    ASSAYMETHODOFNATTOKINASE

    PRINCIPLE

    Nattokinaseactivitycanbeobtainedbythespectrophotometricmeasurementoftheamountofacid-solublelow-molecularproducts,whichisincreasedowingtohydrolysisofthepeptidelinkageswhennattokinaseactsonfibrin.

    DEFINITIONOFACTIVITYUNIT

    Oneunit(1FU)isdefinedastheamountoftheenzymewhichincreasestheabsorbanceofthefiltrateat275nmby0.01perminuteundertheconditionsspecifiedintheprocedure.

    APPARATUS

    (1)Waterbath：37±0.3℃

    (2)Testtubes：15×150mm

    (3)Mixer：YAMATOSCIENTIFICMT－31

    (4)Microtesttubes：EPPENDORF,safelock2.0mL

    (5)High-speedmicrocentrifuge(TheRotorwiththeradiusof4cm)

    (6)Pastuerpipettes：forexampleIWAKIGLASS,9incheslength

    (7)Spectrophotometer

    (8)Cuvette：10mminapathlength,4mminapathwidth

    REAGENTS

    (1)0.05mol／LBoratebuffer(pH8.5,containingNaCl)

    Dissolve19.07gofNa2B4O7?10H2Oand9.0gofNaClinabout900mLofdistilledwater.

    AdjustedpHto8.5withconcentratedHClandadddistilledwatertomake1000mL.

    (2)0.2mol／LTrichloroaceticacid(TCA)solution

    Dissolve32.68gofTCAindistilledwatertomake1000mL.

    (3)0.72%Fibrinogensolution

    Pipettethe10mLof0.05mol／LBoratebufferintoanErlenmeyerflask,add96mgoffibrinogen(SIGMA,FIBRINOGEN(FractionⅠ)TypeⅠ-S:FromBovinePlasma,PRODUCTNUMBERF8630),andkeepstandingforsometime.Grindtheundisolvedwithglassrodtodissolvecompletely.Filtratethemixturethroughafilterpaper(ADVANTEC,No.6,7cm),toremoveinsolublematerials.Preparebeforeuse.〔NoteⅠ〕

    (4)Thrombinsolution

    Dissolvethrombin(SIGMA,FromBovinePlasma,PRODUCTNUMBERT6634)in0.05mol／LBoratebuffertomakethe1000U／mLsolution.Dispenseitlittlebylittleintobottlesandmakethemfreezeforstorage.Diluteoneofthem50-foldwith0.05mol／LBoratebufferbeforeuse.

    (5)1mol／LAceticacidsolution

    Dissolve60.1gofCH3COOHindistill

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