淋巴细胞转化实验.ppt

LOGOLOGO淋巴细胞转化实验第1页，共23页，星期日，2025年，2月5日淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。原理第2页，共23页，星期日，2025年，2月5日T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖；★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；第3页，共23页，星期日，2025年，2月5日分离人外周血单个核细胞（PBMC）分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术)淋巴细胞转化试验实验流程第4页，共23页，星期日，2025年，2月5日实验流程

－－PBMC的分离基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。第5页，共23页，星期日，2025年，2月5日←ＰＢＭＣ←淋巴细胞分离液←红细胞、粒细胞、血小板←血浆第6页，共23页，星期日，2025年，2月5日实验流程

－－淋巴细胞转化实验基本原理：在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。第7页，共23页，星期日，2025年，2月5日形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。（一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。（二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。实验流程

－－结果观察第8页，共23页，星期日，2025年，2月5日（四）3H-TdR掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。?实验流程

－－结果观察第9页，共23页，星期日，2025年，2月5日第10页，共23页，星期日，2025年，2月5日取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1）将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1）（滴管2）.离心之前计数细胞弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml.将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照.B组：加入100ulConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.实验步骤第11页，共23页，星期日，2025年，2月5日A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm值.B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测第12页，共23页，星期日，2025年，2月5日细胞数/ml＝4大格中细胞总数4×104×稀释倍数第13页，共23页，星期日，2025年，2月5日ConA的倍比稀释10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450μL440μL220μL220μLOriginalsampletubetube1tube2220μL第14页，共23页，星期日，2025年，2月5日注意无菌操作操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数将稀释血加于分离液时，动作要轻柔离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档分离不同种属动物的PBMC要用