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一、概述;;;;层析柱——径高比(10:1—1:100)、材质(玻璃、有机玻璃、PVC、不锈钢等)、耐压(0.05-10MPa)等
;泵——恒速、压力(蠕动泵等);自动馏分收集仪(国产);;伯乐公司(BIO-RAD)柱层析系统;发玛西亚公司(Pharmacia)柱层析系统;国产柱层析系统;;;;;;二、色谱分离过程的基本原理;;;三、色谱分离过程和色谱图;1色谱图(chromatogram)
试样中各组分经色谱柱分离后,按先后次序经过检测器时,检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号,由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线,称为色谱流出曲线,或色谱图。如图2
常用术语:
基线在操作条件下,仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。
2.色谱峰当组分随流动相进入检测器时,其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。
3.峰高:色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peakheight)。用h表示。
4.峰面积:峰与峰底之间的面积称为峰面积(peakarea),用A表示。;四、色谱分离过程基础理论;2分离度
相临两组分间峰顶间距离除以此两峰底宽的平均值,衡量色谱分离条件优劣的参数;3柱效率
塔板理论认为,一根柱子可以分为n段,在每段内组分在两相间很快达到平衡,把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L,理论塔板高度为H,则
H=L/n
式中n为理论塔板数。
理论塔板数可根据色谱图上所测得的保留时间(tR)和峰宽(w)或半峰宽(wh/2)按下式计算:
或
;;五、色谱的分类;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;在生物体内,许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等,都具有这种特性。;亲和色谱法的基本过程是:
1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质,连接在水不溶性载体上,制成亲和吸附剂后装柱。
2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱,纯化对象吸附在柱上,其他物质流出色谱柱。
3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱,把吸附在亲和柱上的欲纯化???质洗脱出来。;
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