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冻存和复苏细胞的原则
演讲人：
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目录
CONTENTS
01
冻存前准备规范
02
细胞冻存操作流程
03
复苏过程关键控制点
04
冻存后质量验证
05
设备与材料规范
06
安全与风险控制
01
冻存前准备规范
细胞状态评估标准
确保细胞在冻存前具有高活性，通常选择处于对数生长期的细胞进行冻存。
细胞活性
细胞形态
细胞密度
细胞形态应完整且无明显异常，如细胞萎缩、变形、破裂等。
适当的细胞密度有助于细胞在冻存过程中的存活，通常建议细胞密度达到约80%-90%时进行冻存。
冻存保护液配制要求
保护剂种类
常用的冻存保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、甘油等，其作用是降低冰点、减少冰晶形成，从而保护细胞免受损伤。
保护剂浓度
溶液pH值
保护剂的浓度要适中，过高或过低都会影响细胞的存活率。通常DMSO的浓度为5%-10%，甘油的浓度为10%-20%。
冻存保护液的pH值要适宜，以维持细胞在冻存过程中的生理环境。一般将pH值调至7.0-7.4之间。
1
2
3
分装体积与标记规则
为避免细胞在冻存过程中受到过多的冰晶损伤，每个冻存管中的细胞悬液体积应适中，通常建议为每个冻存管装1-2ml细胞悬液。
分装体积
每个冻存管上应清晰标记细胞的名称、冻存日期、细胞代数、保护剂种类及浓度等信息，以便于后续的管理和使用。
标记信息
选择密封性好、耐低温的冻存管进行细胞冻存，以确保细胞在长时间的低温环境下保持存活。
冻存管选择
02
细胞冻存操作流程
降温梯度控制方法
慢速降温
通过逐步降低温度，使细胞逐渐适应低温环境，减少冰晶形成对细胞的伤害。
快速降温
在细胞进入冰晶形成的高峰期之前，迅速降低温度，使细胞迅速通过冰晶形成区，减少冰晶对细胞的损伤。
分阶段降温
将细胞先放置在-20℃或-80℃的冰箱中预冷，再转入液氮罐中进行深度冻存。
冻存管密封性检测
渗透检测
利用特殊检测仪器检测冻存管是否有漏气或渗透的情况。
03
将冻存管倒置，观察管内是否有气泡，若有气泡则说明密封不严。
02
气泡检测
肉眼检测
检查冻存管盖子是否盖紧，有无松动或裂缝。
01
液氮罐存储位置管理
液氮罐应放置在稳固、水平、通风良好的地方，避免受到撞击和震动。
合适的位置
标识管理
氮气消耗监测
在液氮罐上贴上明确的标签，注明细胞种类、冻存日期等信息，以便于管理和查找。
定期检查液氮罐的氮气消耗情况，及时添加液氮，确保细胞处于恒定的低温环境中。
03
复苏过程关键控制点
快速解冻水温设定
将装有细胞的冻存管快速置于37℃水浴中，进行快速解冻。
常规操作
使用专门设计的解冻装置，确保解冻过程快速且温度均匀。
精确控制
解冻时水温不得超过37℃，以避免对细胞造成热损伤。
避免过高温度
平衡温度
将培养基提前从冷藏环境中取出，置于室温下或培养箱中进行预平衡，使其温度与细胞生长环境相适应。
培养基预平衡处理
避免温差
确保培养基温度与细胞解冻后温度相近，避免因温差过大对细胞造成刺激。
营养成分
选用适合细胞生长的培养基，确保其营养成分和pH值等满足细胞生长需求。
细胞接种密度优化
密度控制
根据细胞类型和生长特性，确定合适的接种密度，避免细胞过密或过疏。
01
均匀分散
将解冻后的细胞均匀分散在培养基中，确保细胞在培养过程中能够均匀生长。
02
接种后观察
接种后定期观察细胞生长情况，及时调整培养条件，以保证细胞生长状态良好。
03
04
冻存后质量验证
存活率检测标准
利用荧光染料与细胞结合后，通过显微镜观察细胞形态和计数，计算存活率。
荧光染色法
流式细胞术
克隆形成率
通过流式细胞仪检测细胞膜的完整性，判断细胞存活率。
通过培养细胞克隆形成率，检测细胞增殖能力和存活率。
微生物污染排查
真菌培养
将冻存细胞接种到真菌培养基中，检测是否有真菌污染。
03
将冻存细胞接种到细菌培养基中，检测是否有细菌污染。
02
细菌培养
无菌培养
将冻存细胞置于无菌环境中培养，观察是否有微生物污染。
01
细胞功能复测指标
细胞增殖能力
通过细胞增殖实验，检测冻存后的细胞增殖能力是否受到影响。
细胞分化能力
通过细胞分化实验，检测冻存后的细胞分化能力是否受到影响。
细胞代谢活性
通过检测细胞代谢活性，判断细胞是否处于正常状态。
细胞凋亡率
通过检测细胞凋亡率，判断细胞是否受到损伤或处于不健康状态。
05
设备与材料规范
冻存设备校准要求
温度控制
确保冻存设备能够达到和维持所需的温度范围，通常为-80°C或更低，以及进行常规的温度监测和记录。
冷冻速率
根据不同的细胞类型，设定合适的冷冻速率，以减少冰晶形成对细胞的损伤。
设备维护
定期进行设备保养，检查冷冻机组的运行状况，确保设备始终处于良好状态。
防护装备选用标准
选用适用于低温环境的防护手套，避免直接接触冷冻物质，防止冻伤。
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