本科生《P》5第五章目的基因制备与克隆策略.pptVIP

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2025-11-14 发布于北京
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本科生《P》5第五章目的基因制备与克隆策略.ppt

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第五章基因工程工具酶

TheTooloftheGeneEngineering;第一节目的基因的制备;;;;;;;;;;;;;;;;;;;第二节目的基因克隆;Chapter6;cDNA

synthesis;★看家基因（Housekeepinggenes）：又称管家基因或持家基因：在所有细胞中均要表达的一类基因，其产物对维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少（forbasiccellularmetabolism），表达水平受环境因素影响较小，在各生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等

Housekeepinggenes:forbasiccellularmetabolism

★每一个细胞都会生产大量的特殊的mRNA

Poly(A)+RNA:eachcelltypeproducedifferentabundance

classesofparticularmRNAs.;★cDNA:complementaryDNA(copyDNA),

poly(A)+RNAastemple

Reversetranscriptase=RTase

Oligo(dT)primer

Alkalinehydrolysis(orRNaseH)toremovemRNAstrand

T4DNApolymerase,klenowfragment

S1nucleasetoproduceablunt-ended;mRNA;mRNA;★blunt-endligation:

S1nucleasedestroytheprotrudingendsofDNA;

DNApolymerase(klenowfragment)fillingtheprotrudingendsofDNA.

Maindisadvantage:

1)isaninefficientprocess,requirehighconcentrationDNAforligation;

2)vectorself-ligatetoproducecircularmolecules

ortheinsert/vectorDNAsmayformconcatemersinsteadofbimolecularrecombinants,usephoshpatase(eitherBAPorCIP)topreventself-ligation;

3)cloningsitedisappearintherecombinantDNA;CCGAATTCGG

GGCTTAAGCC;Adaptors:aresingle-strandednon-complementaryoligomersthatmaybeusedinconjunctionwithlinkers,whenannealedtogetherandbeaddedtothecDNAtoprovidesticky-endcloningwithoutdigestionofthelinkers.;Homopolymertailing:theenzymeterminaltransferaseisusedtoaddhomopolymersofdA,dT,dGordCtoaDNAmolecule.;★Mainadvantage:

1)packaginginvitromaygeneratetherecombinantphage,whichincreasestheefficiencyofthecloningprocess.

2)mucheasiertostoreandhandlelargenumbersofphageclonesthanplasmids.;CloningcDNAinλvectorsusinglinkers:;★genomiclibrary:isoftenusedtodescribeasetofclonesrepresentingtheentiregenomeofanorganism.