第三章基因工程载体.ppt

一、λ噬菌体的生物学特性λ噬菌体的生活周期λ噬菌体的基因组结构和功能λ噬菌体的DNA复制第62页，共129页，星期日，2025年，2月5日1、λ噬菌体的生活周期l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成第63页，共129页，星期日，2025年，2月5日第64页，共129页，星期日，2025年，2月5日2、λ噬菌体的基因组结构和功能l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因线状ds-DNA，两端具有12bp5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）该末端称为cos位点，可被λ编码的末端酶所识别第65页，共129页，星期日，2025年，2月5日第66页，共129页，星期日，2025年，2月5日第67页，共129页，星期日，2025年，2月5日2、λ噬菌体的基因组结构和功能人为将λ噬菌体基因组分为3个区域：左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和一整合切割基因。右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。第68页，共129页，星期日，2025年，2月5日3、λ噬菌体的DNA复制裂解周期早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白的参与。晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA线性排列的多聚体分子。cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。第69页，共129页，星期日，2025年，2月5日第70页，共129页，星期日，2025年，2月5日3、λ噬菌体的DNA复制溶原性周期λDNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现。原噬菌体的删除作用整合作用需要int基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因的协同作用才能实现。第71页，共129页，星期日，2025年，2月5日二、λ噬菌体载体的构建（一）构建λ噬菌体载体的基本原理（二）构建λ噬菌体载体的基本内容1、除去多余的限制酶识别位点2、切除掉λDNA的非必需区3、引入适当的选择标记4、引入无义突变第72页，共129页，星期日，2025年，2月5日（一）构建λ噬菌体载体的基本原理野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆位点。λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段—除去所有与λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入22Kb。第73页，共129页，星期日，2025年，2月5日第74页，共129页，星期日，2025年，2月5日（二）构建λ噬菌体载体的基本内容1、除去多余的限制酶识别位点天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI5个，HindIII7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λDNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。第75页，共129页，星期日，2025年，2月5日通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的λ-噬菌体第76页，共129页，星期日，2025年，2月5日（二）构建λ噬菌体载体的基本内容插入型载体只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体承载10Kb以内外源DNA片断取代型载体具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA片断可被外源DNA片断取代承载20Kb左右外源DNA片断有多克隆位点，即可用作插入型又可用作取代型第77页，共129页，星期日，2025年，2月5日体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）l-DNA载体的构建：缩短长度插入型载