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探秘蛇足石杉内生真菌：乙酰胆碱酯酶抑制活性的发现与评估

一、引言

1.1研究背景与意义

蛇足石杉（Huperziaserrata），又名千层塔，是石杉科石杉属的多年生草本植物，作为一种传统的药用植物，在中国民间被用于治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、瘀血肿痛等疾病。在现代研究中，其活性成分石杉碱甲（HuperzineA）的发现，为蛇足石杉的药用价值开启了新的篇章。石杉碱甲是一种强效、可逆且具有高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEinhibitor），在治疗重症肌无力和早老性痴呆（阿尔茨海默病，Alzheimersdisease，AD）方面展现出显著疗效。阿尔茨海默病作为一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征包括大脑中乙酰胆碱水平的下降、β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积、tau蛋白的过度磷酸化以及神经元的丢失等。由于其复杂的发病机制，目前仍缺乏有效的根治方法，而乙酰胆碱酯酶抑制剂能够通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，减少乙酰胆碱的分解，从而提高大脑中乙酰胆碱的水平，改善神经传递功能，缓解阿尔茨海默病患者的认知障碍症状，成为治疗该疾病的重要药物之一。

然而，蛇足石杉作为一种野生植物，生长缓慢，对生态环境要求苛刻，且分布范围有限。随着对石杉碱甲需求的不断增加，过度采集导致蛇足石杉的自然资源日益枯竭，已被列入中国国家重点二级保护野生植物名录，其开发利用受到了严格的限制。为了解决石杉碱甲资源短缺的问题，科学家们进行了多方面的探索，如化学合成、植物组织培养等方法。化学合成石杉碱甲的过程复杂，成本高昂，且存在立体选择性等技术难题；植物组织培养虽然具有一定的潜力，但目前仍面临着培养条件优化、产量低等挑战。

内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部，而不引起宿主植物明显病害症状的真菌。内生真菌与宿主植物之间存在着复杂的共生关系，它们能够在植物体内定殖并产生各种次生代谢产物，这些代谢产物具有丰富的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等。近年来的研究发现，许多植物内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性成分，为活性物质的来源开辟了新的途径。从蛇足石杉内生真菌中寻找具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的菌株，不仅有望解决石杉碱甲的资源问题，还可能发现新的活性成分和作用机制，为医药领域的发展提供新的契机。对蛇足石杉内生真菌的研究，有助于深入了解植物与内生真菌之间的共生关系，揭示生物多样性的奥秘，为保护和利用这一珍贵的植物资源提供科学依据。

1.2研究目的与内容

本研究旨在从蛇足石杉中分离筛选出具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的内生真菌，并对其活性进行评估，为开发新型乙酰胆碱酯酶抑制剂提供潜在的微生物资源。具体研究内容如下：

蛇足石杉内生真菌的分离与鉴定：采集不同产地的蛇足石杉植株，采用组织块分离法，将蛇足石杉的根、茎、叶等组织进行表面消毒处理后，接种于特定的培养基上，进行内生真菌的分离培养。通过对分离得到的内生真菌进行形态学观察，包括菌落形态、颜色、质地、边缘特征，以及菌丝和孢子的形态、大小、颜色、着生方式等特征，进行初步的分类鉴定。运用分子生物学技术，提取内生真菌的基因组DNA，扩增其核糖体DNA的内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer，ITS）序列，与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析，构建系统发育树，进一步确定内生真菌的种类和分类地位。

内生真菌发酵产物的制备：将鉴定后的内生真菌接种到液体发酵培养基中，在适宜的温度、转速、pH值等条件下进行发酵培养。发酵结束后，采用过滤、离心等方法将发酵液与菌体分离，对发酵液和菌体分别进行处理，获得粗提物，用于后续的活性检测。

乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测：采用经典的Ellman比色法，以碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholineiodide，ATCh）为底物，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5-Dithiobis-(2-nitrobenzoicacid)，DTNB）为显色剂，在乙酰胆碱酯酶的催化作用下，ATCh水解产生硫代胆碱，硫代胆碱与DTNB反应生成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸阴离子，在412nm波长处有最大吸收峰。通过测定加入样品前后反应体系吸光度的变化，计算样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，从而筛选出具有抑制活性的内生真菌菌株。

活性菌株的复筛与活性评估：对初筛得到的具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的内生真菌菌株进行复筛，进一步验证其活性的稳定性和重复性。测定活性菌株发酵产物的半抑制浓度（IC50），即抑制乙酰胆碱酯酶活性50%时所需的样品浓度，以评估其抑制活性的强弱。

1.3研究方法与技术路线

本研究采用了多种研究方法，具体如下：

样品采集：在蛇足石杉的生长季节，选择