类弹性蛋白多肽融合犬干扰素：表达、纯化与活性检测的研究.docxVIP

类弹性蛋白多肽融合犬干扰素：表达、纯化与活性检测的研究

一、引言

1.1研究背景与意义

犬类作为人类亲密的伴侣动物，其健康状况备受关注。犬干扰素作为一种重要的细胞因子，在犬类疾病的防治中发挥着关键作用。干扰素是由干扰素诱生剂作用于细胞膜后，使细胞产生的一种特异因子，它能够与细胞DNA中的干扰素基因抑制物结合，解除抑制作用，从而合成干扰素。干扰素通过“IFN系统”发挥作用，具有广谱的抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗细菌和寄生虫等多种生物学功能。在犬类疾病治疗中，犬干扰素对犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎和犬冠状病毒病等常见病毒性疾病具有显著疗效。

然而，传统的犬干扰素在实际应用中面临诸多挑战。现有重组α干扰素多以组氨酸标签融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体表达，需经过变性、复性和层析纯化等复杂过程，这导致制备成本高昂。并且，此类干扰素在体内半衰期短，需要频繁给药，不仅增加了治疗成本和动物的应激反应，还可能影响治疗效果。

类弹性蛋白多肽融合技术的出现为解决这些问题带来了新的希望。类弹性蛋白多肽（ELP）是一类由五个氨基酸组成的聚合物，具有独特的温度敏感可逆相变特性。在低温时，ELP处于溶解状态，而在高温时则会发生相变，形成不溶性的凝聚物，这种特性使得ELP可用离心等简单方法进行分离纯化，大大降低了纯化成本。此外，ELP还具有良好的生物相容性，被广泛用作体内药物载体，能够起到缓释和延长半衰期的作用。将犬干扰素与ELP融合，有望实现高效表达、低成本纯化，同时延长干扰素在体内的作用时间，提高治疗效果，为犬类疾病的治疗提供更有效的手段，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在犬干扰素表达方面，国内外学者已开展了大量研究。国外早在1987年，Hiummler等就率先对犬的IFN-α基因进行了研究，并报道了犬IFN-α基因序列。1992年，DevosK等成功克隆了犬IFN-γ基因。国内学者也在不断跟进，2002年，杨琪等克隆了犬IFN-γcDNA，并在鼠骨髓瘤细胞中进行表达；2005年，张海峰等实现了重组犬IFN-γ在大肠杆菌中的高效表达。此后，关于犬干扰素的表达研究不断深入，包括对不同亚型干扰素的表达、表达条件的优化以及表达载体的改进等方面。

在类弹性蛋白多肽融合技术的研究上，国外研究起步较早，对ELP的性质、结构和应用进行了广泛探索。ELP已被应用于药物载体、组织工程、免疫测定等多个领域。在蛋白质纯化方面，ELP作为一种新型的纯化标签，展现出了独特的优势，能够简化纯化流程，降低成本。国内近年来也加大了对ELP融合技术的研究力度，清华大学医学院高卫平研究组在国际上率先提出了一种新型、通用、简单、高效的类弹性蛋白多肽融合方法（ELPfusion），用于精准设计蛋白质-高分子偶联物。通过该方法制备的干扰素α-ELP融合蛋白（IFN-ELP）具有产率高、成本低、生物活性保持好以及药代和药效显著提高等优势。

尽管目前在犬干扰素表达和类弹性蛋白多肽融合技术方面取得了一定进展，但仍存在一些不足之处。在犬干扰素表达中，如何进一步提高表达量和活性，以及降低生产成本，仍是需要解决的问题。对于类弹性蛋白多肽融合技术，虽然ELP在蛋白质纯化和药物递送方面展现出了潜力，但在犬干扰素融合应用中的研究还相对较少，融合蛋白的稳定性、活性以及体内药代动力学等方面还需要深入研究。此外，现有研究在融合蛋白的规模化制备和质量控制方面也存在一定挑战，限制了其临床应用和产业化发展。

1.3研究目的与内容

本研究旨在通过基因工程技术，实现类弹性蛋白多肽融合犬干扰素的高效表达、纯化，并对其活性进行检测，为犬类疾病的治疗提供更有效的生物制剂。具体研究内容如下：

融合基因的构建：根据犬干扰素基因和类弹性蛋白多肽基因序列，设计并合成融合基因，将其插入合适的表达载体中，构建重组表达质粒。通过PCR扩增、酶切鉴定和测序等方法，确保融合基因的正确性和完整性。

融合蛋白的表达：将构建好的重组表达质粒转化到大肠杆菌表达系统中，优化诱导表达条件，包括诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间等，以实现融合蛋白的高效表达。通过SDS-PAGE分析，检测融合蛋白的表达情况，并确定最佳表达条件。

融合蛋白的纯化：利用类弹性蛋白多肽的温度敏感可逆相变特性，采用简单的离心方法对融合蛋白进行纯化。优化相变温度、盐浓度等相变循环（ITC）参数，提高融合蛋白的纯度和回收率。通过透析等方法去除杂质，获得高纯度的融合蛋白。

融合蛋白的活性检测：采用MDCK/VSV系统等方法，对纯化后的融合蛋白进行抗病毒活性检测。通过测定融合蛋白对病毒感染细胞的抑制作用，评估其抗病毒活性，并与传统犬干扰素进行活性比较