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TCID50测定方案
2012112339
1简介
TCID50(TissueCultureInfectiveDose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在
半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathiceffect，CPE)的病毒量。
将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记
录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。
2试剂
试剂来源保存条件
DMEM-basic培养基Gibco，上海4℃保存
胰蛋白酶Gibco，-20℃冻存
胎牛血清FetalbovineserumHyclone，-20℃冻存
PBSHyclone，-20℃冻存
3仪器与耗材
仪器规格耗材规格
CO培养箱细胞培养瓶25cm2
2
生物安全柜无菌离心管15mL，50mL
倒置显微镜一次性移液管1mL，2mL，5mL，10mL
显微照相系统细胞培养板96孔
高速冷冻离心机
电子天平
移液器
液氮罐
电冰箱
4细胞及培养基
DF-1细胞株
细胞生长液（500mL）：20%FBS（胎牛血清）+1%双抗（青链霉素）+剩余用DMEM
100mL5mL395mL
细胞维持液（50mL）：1%双抗（青链霉素）+DMEM（无血清）+1%FBS0.5mL
49mL0.5mL
细胞冻存液（50mL）：70%DMEM-basic+20%FBS+10%DMSO
35mL10mL5mL
4℃保存备用
5病毒株及培养方法
禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV），H5N1株；禽白血病病毒（Avianleukosisvirus，ALV），
HPRS-103株；禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV），H52株；
禽传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV），B87株。
病毒培养方法：DF-1细胞培养和鸡胚培养。
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6操作步骤
6.1DF-1细胞的传代
1.吸弃细胞培养瓶中旧的培养液；
2.加入灭菌PBS5mL清洗细胞，重复两次；
3.加入1ml0.25%的胰蛋白酶消化；
4.约40s左右（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞
生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散，之后取两
只新的细胞培养瓶，开盖待用；
5.向原细胞瓶中再加入细胞生长液10mL，并吹吸混匀，然后吸取约7ml细胞悬液加入到2个新的
培养瓶中；
6.37℃5%CO中培养3天，期间
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