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演讲人：
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养菌实验流程图
CATALOGUE
目录
01
实验前期准备
02
养菌核心步骤
03
监测与记录流程
04
数据分析与评估
05
安全与质量控制
06
总结与后续步骤
01
实验前期准备
菌种选择与保存
明确目标菌株的营养需求，选择适合的碳源（如葡萄糖、乳糖）、氮源（如蛋白胨、酵母提取物）及无机盐（如磷酸盐、镁盐），必要时添加生长因子或抗生素。
培养基成分筛选
耗材与容器准备
准备无菌培养皿、锥形瓶、移液管、枪头等耗材，确保材质符合无菌要求（如耐高压灭菌的聚丙烯或玻璃制品），避免使用可能抑制菌体生长的塑料制品。
根据实验需求选择目标菌株，确保菌种活性良好，优先选用标准菌株库提供的冻干菌种或甘油保藏菌种，避免使用传代次数过多的菌株。
材料清单与选择
对高压蒸汽灭菌锅进行空载测试，确认温度与压力传感器精度，确保灭菌条件达到标准（如121℃、15psi维持20分钟），定期校验设备密封性。
灭菌设备调试
使用标准温度计验证培养箱内部温度均匀性，设定目标培养温度（如37℃），记录多点温度波动范围（±0.5℃内为合格），避免局部过热或温度不足。
恒温培养箱校准
运行前检查HEPA过滤器完整性，进行风速测试（垂直流风速应保持在0.3-0.5m/s），确保操作区洁净度达到ISO5级标准，防止交叉污染。
生物安全柜检测
01
02
03
设备配置与校准
培养基配制步骤
称量与溶解
按配方精确称量各组分（如蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L），先用适量蒸馏水溶解难溶成分（如琼脂粉），加热搅拌至完全透明，避免局部结块或焦化。
分装与灭菌
将培养基分装至锥形瓶（液体）或培养皿（固体），液体装量不超过容器容积的2/3，固体培养基倾注时保持厚度均匀（约3-4mm），高压灭菌后避光保存备用。
pH调节与过滤
冷却至60℃后使用pH计检测并调节至目标值（如7.2±0.2），必要时用氢氧化钠或盐酸微调，液体培养基需通过0.22μm微孔滤膜除菌过滤。
02
养菌核心步骤
通过分区划线将菌液均匀涂布于固体培养基表面，促进单菌落形成，便于后续纯化与鉴定。
划线分离法
将菌种接入液体培养基时需控制接种量（通常为1%-5%体积比），避免因菌液过浓导致溶氧不足。
液体接种法
01
02
03
04
接种过程需在超净工作台或生物安全柜中进行，使用酒精灯火焰灭菌接种环，避免杂菌污染。
无菌操作技术
适用于厌氧菌或半固体培养基接种，使用直针垂直刺入培养基深层，观察菌株动力特性。
穿刺接种法
接种方法与操作
生长环境参数设置
根据不同菌种需求设置恒温培养条件（如大肠杆菌37℃，霉菌25-28℃），使用精度±0.5℃的恒温培养箱。
温度控制
固体培养时保持培养箱湿度60-80%，防止培养基脱水；液体培养需密封摇瓶防止蒸发。
湿度管理
需氧菌需保证充足氧气供应，厌氧菌需使用厌氧罐或专用培养箱，微需氧菌需维持5-10%氧气浓度。
气体环境调控
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02
培养基初始pH需校准至菌株最适范围（如细菌6.5-7.5，酵母4.5-5.5），必要时添加缓冲体系。
pH值调节
04
通过OD600值监测菌液浓度，当菌群进入对数生长期（OD6000.4-0.8）时进行后续实验。
针对抗生素等次级代谢产物，需延长培养至稳定期后期，此时产物积累量达到峰值。
采用恒化器或恒浊器维持菌群持续生长，适用于工业化发酵或长期生理学研究。
选择对数生长后期的菌体进行甘油保藏或冻干处理，此时菌体活性高且代谢稳定。
培养时间优化
对数生长期判定
次级代谢产物收集
连续培养技术
菌种保藏时机
03
监测与记录流程
生长状态观测技术
光学显微镜观察
通过高倍镜检直接观测菌落形态、密度及分裂状态，结合染色技术（如革兰氏染色）区分活菌与死菌比例。
生物量测定
通过pH计、溶氧仪监测培养液酸碱度及溶解氧变化，间接反映菌群代谢强度及生长阶段特征。
采用分光光度计测量菌液OD值（600nm波长），量化菌群生长曲线，同步结合干重法校准数据准确性。
代谢活性分析
数据采集频率与方式
配置传感器与数据记录仪，每2小时自动记录温度、湿度、CO2浓度等环境参数，确保数据连续性。
定时自动化采集
每日固定时段进行人工采样，通过平板计数法或PCR技术验证自动化数据，避免仪器误差导致结果偏差。
人工复核节点
原始数据同步备份至本地数据库与云端，采用时间戳加密存储，确保数据可追溯性与安全性。
多模态存储
01
02
03
污染应急protocol
若OD值持续无变化，需排查培养基成分（如碳氮比）、环境参数（如温度波动）或菌种活性，并保留异常阶段影像资料。
生长停滞分析
设备故障响应
数据采集中断时，启用备用设备补测，并在日志中标注故障原因及补救措施，确保实验完整性不受影响。
发现非目标菌种污染时，立即隔离样本并记录污染
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