菌种传代与保藏作业指导说明书.docxVIP

菌种传代和保藏作业指导书

1.标准菌起源

标准菌株必需购置含有资质菌种保藏中心提供冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。

2.标准菌验收

从菌种保藏中心购置原始菌种管是玻璃安瓿装冻干菌，接收同时应检验是否有随菌种附有相关资料。接收菌种时应检验安瓿数量和名称，和每一支安瓿完整性。在对应菌种接收统计上记上全部相关菌种信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包含：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、使用期至。新购入0代原始菌种储存于－20℃，使用期为三年。购置已接种好菌种斜面（3代）应检验菌种管是否完好。储存于2～8℃，使用期为3个月。

3.标准菌复苏、复壮及标准贮备菌株制备

3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球

3.2培养基

改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.

营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3.3操作步骤：

a.打开洁净工作台。

b.在安瓿外表面用75%酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必需小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好上述液体培养基中移取0.5～0.8ml到安瓿中。

e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充足混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到对应液体培养基。

g.依据安瓿上所标明不一样菌种类型而将其培养于对应温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～二十四小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.取经复苏后上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后菌种中加入100ml20%无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按次序进行编号，最终一支做为质控管进行质量控制，即进行对应确实定。其它作为贮备管。黑曲霉h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后菌种中加入20ml、30%无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按次序进行编号，最终一支做为质控管进行质量控制，即进行对应确实定。其它作为贮备管。将上述制备好冻存管逐支粘贴标签。内容包含：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、使用期至等。

i．贮备菌种管制备成功，储存于－20℃，使用期为三年。

3.4菌种确定

用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或对应宜于该细菌生长判别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；一样方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。

3.5污染处理

假如在该平板上发觉有其它菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了培养物灭菌处理。可寻求原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备贮备菌种管

3.6菌种传代和保藏

将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，所以，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心取得冷冻干燥菌种为第0代，冷冻干燥原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超出5代。

菌种传代保藏过程3.3项下标准菌复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定时传代(W3)，一类用于试验用（S3）。

定时传代用菌传代其操作步骤以下（斜面接种法）：

（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

（2）将装有新鲜配制培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。

（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随立即接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返经过三次。

（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少许菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。

（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端