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免疫学实验方法手册

一、免疫学实验方法概述

免疫学实验方法是在分子、细胞和群体水平上研究免疫系统结构、功能及其与疾病关系的实验技术。这些方法广泛应用于基础医学、临床诊断、生物制药等领域。本手册旨在提供一套系统、规范的免疫学实验操作指南，帮助研究人员高效、准确地开展相关实验。

二、基础免疫学实验方法

（一）细胞培养技术

1.培养基配制

(1)基础培养基：常用DMEM、F12或RPMI-1640，需添加1%青霉素-链霉素。

(2)加血清：10%-20%胎牛血清（FBS），需预温37℃灭活30分钟。

(3)其他添加剂：根据实验需求加入双抗、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸等。

2.细胞接种

(1)细胞计数：使用血球计数板或细胞计数仪，确保细胞密度在1×10^5-1×10^6/mL。

(2)接种步骤：用移液器吸取细胞悬液，缓慢加入培养皿/瓶，轻柔晃动混匀。

(3)温育：37℃、5%CO2培养箱中培养48-72小时。

（二）ELISA检测技术

1.试剂准备

(1)试剂盒：选择辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的抗体。

(2)底物：TMB或OPD，需现配现用，避光保存。

2.操作步骤

(1)包被：将抗原或抗体包被于酶标板，4℃过夜。

(2)洗涤：用PBST或TBS溶液洗涤3次，每次5分钟。

(3)结合：加入生物素化抗体或HRP/AP标记抗体，37℃孵育1小时。

(4)显色：加入TMB/OPD底物，避光反应15-30分钟。

(5)终止：加入硫酸终止液，混匀后酶标仪检测吸光度值（OD450）。

（三）流式细胞术分析

1.细胞染色

(1)固定：收集细胞后用4%多聚甲醛固定，冰上30分钟。

(2)封闭：加入PBS含1%牛血清白蛋白（BSA），37℃封闭30分钟。

(3)染色：加入荧光标记抗体（如CD3-FITC/CD8-PE），冰上避光孵育30分钟。

2.仪器设置

(1)参数选择：设门区排除死细胞（PI染色），检测目标细胞群。

(2)数据采集：每份样本采集1×10^4-1×10^6个细胞，重复3次。

三、高级免疫学实验方法

（一）WesternBlotting技术

1.蛋白提取

(1)细胞裂解：用RIPA裂解液（含PMSF）冰上裂解30分钟。

(2)离心：12,000rpm离心10分钟，取上清。

2.电泳及转膜

(1)SDS：上样50-100μg蛋白，100V预电泳30分钟，200V电泳1.5-2小时。

(2)转膜：湿转法，30V转膜1小时，用甲醇预湿润PVDF膜。

3.检测

(1)一抗：5%脱脂奶粉封闭1小时，加入稀释抗体（1:1000），4℃过夜。

(2)二抗：TBST洗涤3次，加入HRP标记的二抗（1:5000），室温孵育1小时。

(3)显影：ECL化学发光液孵育，凝胶成像系统采集图像。

（二）免疫荧光技术

1.染色流程

(1)冷丙酮固定：-20℃固定10分钟，PBS洗涤3次。

(2)封闭：PBS含5%血清封闭1小时。

(3)染色：加入荧光二抗（如AlexaFluor488/594，1:200），37℃孵育1小时。

(4)标记：DAPI复染细胞核，封片剂封片，荧光显微镜观察。

2.注意事项

(1)避光操作：荧光标记过程需避光，防止淬灭。

(2)抗体优化：根据细胞类型调整抗体浓度及孵育时间。

四、实验结果分析与记录

（一）数据标准化

1.内参对照：加入β-actin或GAPDH作为内参，校正样本差异。

2.空白对照：未加抗体或抗原的对照孔，排除非特异性信号。

（二）结果呈现

1.图表格式：柱状图、折线图或散点图，标注误差线（SD或SEM）。

2.记录规范：详细记录实验条件、试剂批号、操作人及原始数据。

（三）常见问题排查

1.非特异性结合：增加封闭时间或更换抗体。

2.信号弱：检查抗体效价或优化孵育条件。

3.细胞凋亡假阳性：用AnnexinV/PI联合染色排除。

**二、基础免疫学实验方法**

**（一）细胞培养技术**

细胞培养是免疫学研究的基石，它允许我们在体外模拟或研究细胞的正常生理功能、免疫应答以及药物作用。本部分详细阐述常规细胞培养的基本流程和关键注意事项。

1.**培养基配制**

细胞培养基是提供细胞生长所需营养物质和维持其生理状态的关键介质。其配制需严格遵循无菌原则和标准化操作。

(1)**基础培养基选择与配制**：

***常用种类**：DMEM（DulbeccosModifiedEagleMedium）、F12（HamsF-12Medium）或RPMI-1640是常用的基础培养基，它们分别适用于不同类型的细胞。例如，RPMI-1640常用于淋巴细胞的培养，而DMEM则更适合上皮细胞和成纤维