大肠杆菌质粒提取实验步骤.pdfVIP

基因工程制药技术

实验一、大肠杆菌质粒DNA提取实验

实验原理：

质粒是存在于细菌和真菌当中的小型环状的DNA分子，质粒可以以游离的形式存在

于细胞质当中，有时候也会整合到细胞的染色体DNA中，由于质粒具有自己的DNA复制

及基因表达调控系统，因此常被用作基因工程操作中的载体，用于携带外源的目的基因，

进入宿主细胞或者用作基因表达的媒介。纯化后的质粒可以用作载体构建重组子，或者

用作DNA模板扩增目的基因。目前，很多质粒已经实现商业化，我们在得到一个质粒后，

通常也需要先进行转化，使其扩增再提取，用于后续的实验。目前针对质粒提取的试剂

盒有很多，但是我们在操作中也需要注意一些细节，因为这些操作将影响后续质粒的得

率和纯度，下面我们来了解一下质粒提取的原理。从大肠杆菌当中提取质粒的方法有很

多，其中碱裂法是最常用的一种方法，也是目前大部分商业化试剂盒所采用的方法。该

方法是基于染色体DNA和质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。首先使用溶

菌酶和SDS处理使细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，在强碱环境中，染色体DNA和质粒

DNA均发生变性，当溶液的pH值恢复到中性的时候，由于质粒的DNA以超螺旋共价闭

合环状的形式存在，因此它的两条互补链不会互相分开，便可以溶解到溶液当中，而染

色体DNA不容易复性，两条链相互缠绕，在离心的过程当中会与蛋白质SDS复合物一起

沉淀下来，因此通过离心便可以使质粒与其他生物大分子相互分开。通过收集溶解有质

粒的上清液，在经过DNA吸附柱的吸附以及后续的洗脱步骤，便可以得到纯化的质粒。

实验仪器：超净工作台，恒温震荡摇床、台式高速离心机，微量加样器。

实验材料：PET-30a的大肠杆菌，质粒提取试剂盒。

实验方法：

1、菌种培养，即质粒扩增，挑取LB固体培养基上的单菌落，接种于1-4mL含有氨

苄青霉素的LB液体培养基中。37℃、250r/min震荡培养12-16小时。

2、收集菌体，取1.5mL过夜培养菌液，12000r离心2分钟，弃上清。

3、试剂盒提取、纯化质粒。

3.1向细菌沉淀中加入250uL的SolutionⅠ（含有RNaseA）用枪吹打充分悬浮细

菌沉淀。注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器等剧烈震荡使菌体充分悬浮。本步骤

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的主要作用是细胞重悬及清除RNA污染。

3.2加入250uL的SolutionⅡ轻轻上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透

明溶液。注意在操作过程中轻轻颠倒混合，不可剧烈震荡。本步骤可以使细胞裂解，释

放DNA和质粒。操作时间不宜超过5分钟，否则容易使DNA降解。

3.3加入350uL4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实

凝集块，然后室温静置2分钟。室温12000r离心10分钟，取上清。进行下一步的纯化。

3.4准备DNA纯化小柱，套入1.5mL的PE管当中。将溶有质粒的上清加入纯化小

柱，12000r离心1分钟，弃滤液。质粒DNA被吸附在纯化小柱上。

3.5将500uL的BufferWA加入纯化小柱，12000r离心30秒，保留纯化小柱，弃滤

液。

3.6将700uL的BufferWB加入纯化小柱，12000r离心30秒，保留纯化小柱，弃滤

液。BufferWB为含量约为70%的乙醇溶液，用于清洗非DNA成分。重复上一步操作。

3.7重新将纯化小柱安装在PE管上，12000r离心1分钟，除尽残留洗液。将纯化

小柱安置与新的1.5mL的离心管上，向小柱中央处加入50uL的ElutionBuffer，室温

静置1分钟。12000r离心1分钟，洗脱DNA。回收洗脱液，质粒DNA溶解其中。弃掉纯

化小柱，质粒DNA提取完成，低温保存。