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猪β干扰素在毕赤酵母中的高效表达与蛋白活性解析：关键技术与作用机制研究

一、引言

1.1研究背景

在病毒学和免疫学领域，干扰素（Interferon，IFN）自1957年被Isaacs和Lindenmann发现以来，一直是研究的重点。干扰素是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，能够干扰病毒复制、调节免疫系统，在机体抗病毒防御中发挥着关键作用。其抗病毒作用主要体现在直接激活免疫细胞，间接抑制病毒的复制过程，从而控制病毒的生长和增殖，在控制病毒感染、阻止病毒在机体内扩散，以及促进病毒性疾病的痊愈等方面起到了重要作用。

目前，根据抗原特异性和作用受体的不同，干扰素被分为多种类型，其中α、β、γ干扰素较为常见且功能独特。猪β干扰素（PoIFN-β）主要由成纤维细胞产生，具有诱导细胞产生多种抗病毒蛋白、增强自然杀伤细胞的活性、增加抗原递呈细胞MHCI型分子表达以及抑制白细胞增殖等功能。在养猪业中，猪病的防治一直是关乎产业发展和经济效益的重要问题。由病毒、细菌等病原微生物侵染猪所引起的各种传染性疾病，不仅严重制约了养猪业的健康发展，还对人类健康存在着巨大隐患，如猪流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）等，每年都给全球养猪业造成巨大的经济损失。这些病毒感染猪后，可导致猪生长发育受阻、免疫力下降，甚至死亡。猪β干扰素具有抗病毒、调节免疫等功能，在猪的抗病毒防御体系中发挥着关键作用，既可以与疫苗配合使用，增强免疫效果，也可以单独使用，治疗猪病毒性疾病，提高动物的免疫机能。因此，深入研究猪β干扰素，对于揭示猪的抗病毒免疫机制、开发新型抗病毒药物和疫苗具有重要的理论和实践意义。

1.2毕赤酵母表达系统的优势

毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。毕赤酵母表达系统具有诸多优点：首先，其含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；其次，表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达，且绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高，一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；再者，发酵工艺成熟，易放大，已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升；同时，培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；另外，外源蛋白基因遗传稳定，一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；最后，作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。在表达猪β干扰素方面，毕赤酵母表达系统能够对猪β干扰素进行正确的折叠和翻译后修饰，使其具有更好的生物学活性，且其高效的表达水平和易于放大的发酵工艺，为猪β干扰素的大规模生产提供了可能。

1.3研究目的与意义

本研究旨在应用毕赤酵母表达系统来分泌表达有活性的重组猪β干扰素，并深入研究表达蛋白的活性。通过本研究，期望实现猪β干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达，获得具有高活性的重组猪β干扰素蛋白。这不仅能够为猪β干扰素的生物学功能研究提供充足的实验材料，也可为猪β干扰素的产业化应用提供理论依据和技术支持，有助于开发新型的猪用抗病毒生物制剂，提高养猪业对病毒性疾病的防控能力，减少病毒感染给养猪业带来的经济损失，促进养猪业的健康发展。

二、猪β干扰素基因的克隆与表达载体构建

2.1猪β干扰素基因的获取

本研究选用健康猪的肝脏组织作为提取猪β干扰素基因的材料。将采集的新鲜肝脏组织用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，以去除表面的血液和杂质。随后，按照高盐法提取基因组DNA的标准流程进行操作。先将洗净的肝脏组织切成小块，放入预冷的含有高盐溶液的细胞裂解液中，在冰上裂解30分钟，期间间歇性地使用匀浆器研磨组织，以确保细胞充分裂解，使细胞膜和核膜破裂，释放出DNA。接着，向裂解后的样品中加入蛋白酶K，在55℃条件下消化2小时，以彻底去除蛋白质，防止蛋白质与DNA结合，干扰后续DNA提取。消化完成后，加入高盐溶液，使DNA沉淀下来，通过离心收集DNA沉淀。再用70%乙醇洗涤沉淀2次，去除残留的蛋白质和盐分，确保DNA纯度。最后，将沉淀用TE缓冲液溶