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实时荧光单引物等温扩增技术：海产品中副溶血性弧菌检测的创新突破

一、引言

1.1研究背景与意义

1.1.1海产品安全与副溶血性弧菌的威胁

海产品作为人类饮食结构中不可或缺的重要组成部分，凭借其丰富的营养成分和独特的风味，深受广大消费者的喜爱。海洋被誉为“蓝色粮仓”，海洋生物种类占全球物种的80%以上，是食物和药物原料的重要来源，为人类提供了丰富的优质蛋白质、Omega-3脂肪酸、维生素和矿物质等营养物质。其中，优质蛋白质有助于维持肌肉质量、促进修复和生长；Omega-3脂肪酸对心脏健康至关重要，能够降低心血管疾病的风险，同时有助于改善大脑功能、减少炎症；维生素D有助于钙的吸收，促进骨骼健康，维生素B12支持神经系统功能，预防贫血，碘对甲状腺功能至关重要，硒具有抗氧化和增强免疫作用，保护心血管和心肌的健康。此外，大多数海鲜的脂肪含量较低，尤其是饱和脂肪含量少，有助于控制体重和降低慢性疾病的风险。在日本，海产品如生鱼片、贝类和海藻在饮食中占有重要地位，日本人以大量蔬菜、海产品、豆类和米饭为基础的饮食，富含营养物质，低脂低盐，这也是他们长寿的秘诀之一。

然而，随着全球海洋环境的变化以及海产品生产、加工、流通环节的日益复杂，海产品安全问题逐渐凸显，其中副溶血性弧菌的污染尤为突出，给人类健康和食品安全带来了严重威胁。副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于海水、淡水、土壤以及各类海产品中。该菌具有嗜盐性，在近海岸的海水、海底沉积物以及鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中大量存在。人一旦食用了被副溶血性弧菌污染且未煮熟的海产品，极易引发食物中毒。其致病机理主要是通过侵入人体胃肠道，释放毒素，导致肠道黏膜损伤，引发一系列胃肠道症状。患者通常会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，严重者可能出现脱水、休克甚至死亡等危及生命的并发症。据相关研究统计，在细菌性食物中毒案例中，由副溶血性弧菌引起的食物中毒比例较高，危害极大。在我国，每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道，近年来世界发病率也呈上升趋势。在沿海地区，由于居民对海产品的消费量较大，副溶血性弧菌食物中毒事件更为常见，夏季和秋季是高发季节，这与气温和湿度等环境因素密切相关，此时海水温度升高，有利于副溶血性弧菌的生长繁殖。此外，老年人、儿童、孕妇等免疫力较低的人群更易感染副溶血性弧菌，一旦感染，病情往往更为严重。

1.1.2传统检测方法的局限与新技术的需求

传统的副溶血性弧菌检测方法主要依赖于培养和生化试验。这些方法通常需要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等多个复杂的过程。首先，在样品采集后，需要将其接种到特定的选择性培养基，如TCBS琼脂上，通过观察菌落形态和颜色变化来初步鉴定副溶血性弧菌。然后，将可疑菌落进行分离与纯化，通过划线分离法获得纯培养物，并进一步观察细菌在培养基上的生长特性，如生长速度、菌落形态等，以辅助鉴定。接着，利用副溶血性弧菌具有氧化酶活性的特点，通过氧化酶试剂进行快速初步鉴定，同时利用细菌对不同碳水化合物的发酵特性进行鉴定，如葡萄糖、甘露醇等，以及检测细菌是否能产生吲哚，用于区分副溶血性弧菌与其他近似菌种。最后，还需要进行血清学反应，利用特异性抗体与细菌表面抗原结合形成凝集现象，进行快速鉴定。然而，这些传统方法存在诸多局限性。一方面，检测过程繁琐，需要耗费大量的时间和人力，整个检测流程通常需要5-6天才能完成，这对于需要快速得知检测结果的海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等工作来说，时效性太差，严重影响了工作效率和经济发展。另一方面，传统检测方法的灵敏度较低，容易受到其他微生物的干扰，导致假阴性或假阳性结果的出现，从而漏检或误检副溶血性弧菌，给食品安全带来潜在风险。

随着科技的不断进步和人们对食品安全要求的日益提高，开发一种快速、灵敏、准确、特异的副溶血性弧菌检测技术迫在眉睫。实时荧光单引物等温扩增技术作为一种新型的核酸等温扩增技术，应运而生。该技术具有操作简便、反应迅速、灵敏度高、特异性强等优点，能够在等温条件下快速扩增目标核酸序列，通过实时监测荧光信号的变化，实现对副溶血性弧菌的快速检测。与传统检测方法相比，实时荧光单引物等温扩增技术无需进行复杂的温度循环，大大缩短了检测时间，同时减少了外界因素对检测结果的干扰，提高了检测的准确性和可靠性。因此，研究实时荧光单引物等温扩增技术在海产品中副溶血性弧菌检测中的应用，对于保障海产品安全、维护消费者健康具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

国内外学者在副溶血性弧菌检测方法方面进行了大量的研究。传统培养法作为目前应用最广泛的检测方法之一，虽然准确度高，但其检测周期长，易受其他微生物干扰，难以满足快速检测的需求。免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELIS