单细胞藻平板分离技术.docxVIP

实验单细胞藻的分离（二）平板分离纯化技术

一、?实验目的：

本实验的目的是使学生熟悉并掌握利用平板分离单细胞藻类的技术。

二、?分离原理：

用平板分离纯化藻种，一般可分为划线，喷雾和倾注平板等方法。其共同点是分离用水样首先经过适当稀释，再使水样分散到固体平板培养基上。等藻类在平板上成藻团时进一步分离，直至成单种。

三、?实验器材：

中试管，大试管，培养皿，移液管，烧杯，分装漏斗，血球计数板，计数器，接种针，喷雾器，营养盐成分，待分离单胞藻等。

四、方法和步骤：

1、培养基的制备配方如下：

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1000ml培养基中的加入量

100ml培养基中的加入量

N—4（F/2）N

1ml（相当于4mlF/2N）

8滴*(F/2N)

P—4（F/2）P

1ml相当于4mlF/2F）

8滴

EDTA-Na2

1ml（4*36.3um储液）

2滴

柠檬酸铁

0.5ml(1%储液)

1滴

Soilextract（浓)

1ml

2滴

Agar

12g

1.2g

SeaWater

1000ml

100ml

*每ml约等于20滴

（1）将试管、培养皿、移液管等玻璃工具在烘箱中消毒。

（2）在烧杯中加入100ml海水，水位标号。称取1.2g琼脂，撕碎加入海水中，在电炉上加热，不断搅拌至琼脂完全溶化。损失的水分用蒸馏水调整。

（3）按配方比例加入各营养成分、搅匀。

（4）分装试管：每组分装中试管12支（5ml/支），大试管4支（20ml/支），无菌海水3支（9ml/支），标明班组。

（5）高压灭菌：15磅/时2、121℃、20分钟。稍冷却后在超净工作台内分装试管，完成后置斜面，在培养皿中倒平板2、分离：

（1）分离前的水样先用血球计数板浓度，一般以每毫升1000—5000个为宜，太浓时

应先进行稀释。用灭过菌的1ml移液管吸取1ml水样加入9ml无菌海水中，换一移液

管进行第二次，第三次稀释，稀释水样标号。

（2）喷雾法：

将稀释好的水样（10-2、10-3）装进灭好菌的喷雾器中，对准事先做好的平板进行喷雾，然后盖好，放入光亮处培养。

（3）倾注法：

用灭过菌的移液管吸取1ml稀释过的水样（10-1、10-2）加入事先先灭过菌的培养皿中，接着倒入45℃的培养基（保存在恒温水浴中）轻轻摇动一下使水样和培养基混合均匀，放在光亮处培养。

（4）??????固体斜面大接种：

等藻团长出后，镜检是否为单种，如不是单种，进一步进行平板划线分离，至单种时，用接种环挑取藻体在斜面上划线。

1、结果与记录

几天后观察藻类生长情况并进行记录，描述（包括培养条件）将结果写进实验报告，交实物和报告。

注意：

1、用于倾注法的水样应比喷雾法浓一个数量级，因为多数海水藻类的最适温度为25℃左右。加入45℃培养基时必有一部分藻类被烫死不能生长繁殖。

2、培养条件非常重要，要求一定的温度（25℃左右。根据藻种不同而异）和一定光照。否则藻类不能生长而细菌则大量繁殖，导致分离失败。