光学显微镜技术1.pptVIP

一、分类：透射电镜（TransmissionelectronMicroscopeTEM）扫描电镜（ScanningelectronMicroscopeSEM）1、透射电镜1）、透射电镜标本制备过程:取材:尽可能保持生活状态,避免损伤必须耐真空由于电子穿透力弱,标本必须超薄标本反差应尽可能大(生物材料原子系数低,图像反差差,不易出现明暗差别)固定:为防止生物样品在死亡后和脱水过程中产生结构改变,离体生物标本迅速固定。常用戊二醛和四氧化锇固定戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键,将它们交联在—起。四氧化锇除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。脱水:标本必须置于高真空中进行电镜观察,但电镜不能观察含水的生物标本，因此需经脱水处理。另外由于包埋剂与水不溶，用脱水剂可将组织中游离水脱去，有利包埋。包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击,则在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚的薄片。染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成,.它们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,为加大生物样品反差,进行染色。常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。2）、提高样品反差的方法负染法(negativestaining):将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上,滴加磷钨酸,样品干燥后重金属盐沉积于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。真空镀膜法(meta1shadowing):把铂或钯等重金属接受高温蒸发,金属颗粒以一定倾斜角度喷落在样品表面形成不同厚度的薄膜,膜的厚度反映了样品的表面轮廓，主要观察病毒、噬菌体或大分子的形状。整装细胞电镜技术:应用高锰酸钾固定剂,将细胞中大部分蛋白质性结构破坏,而内质网等膜性细胞器保存下来。这样不需超薄,细胞中的内质网膜系统及高尔基复合体、溶酶体和线粒体等膜性结构就能显现出来。冷冻蚀刻复型电镜技术(freezeetchingrep1icae1ectronmicroscopy)将标本用液态超低温冷冻,真空中割断,升温使冰升华,细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,膜和其它一些结构显露出来,增强了断面的浮雕效果－蚀刻。标本蚀刻后以45°喷金,90°喷碳后将组织溶解掉,剩下的碳-金属膜就是复型。将复型膜置于透射电镜下观察,可观察蚀刻面所暴露的各种微细结构。冷冻：制冷剂（一般为液态氮）快速冷冻，使样品固定。断裂：在低温真空中将样品劈开，断裂面上可见各种细胞内结构蚀刻：升温使冰升华，细胞内外含水多的地方因失水而下陷，膜和其它结构显露出来，增强了断面的浮雕效果。复型：以45°喷铂金，90°喷碳固定，显示立体结构剥膜：将样品取出，浸泡于腐蚀夜中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂－碳复型膜，捞于载网上干燥后透射电镜观察扫描电镜照片展示注射针头的扫描电镜照片扫描电镜照片展示不同倍率的果蝇扫描电镜照片一、显微镜与分辨率1.明视距离：物体在人眼视网膜上成像的大小和物体与眼睛的距离有关。物体离眼睛的距离越近，视网膜上的物像就越大，但眼睛的曲光度就随之增大，眼部肌肉就越发疲劳。经测试在物体离人眼25cm时，看物体又清楚，眼肌也不疲劳，因此把人眼正常工作距离定为25cm，称之为明视距离。2、分辨力和光镜的分辨极限分辨力（Resolution）：又叫分辨本领，是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。分辨极限（Limitofresolution）对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2?m。R＝0.61?/n.sin?＝0.61×0.5?m/1.5×1＝0.2?m数值孔径N.A（n.sin?）数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越