核酸的组成与理化性质.pptVIP

根据限制酶的结构，辅因子的需求，切割位点与作用方式等，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，同时具有修饰及认知切割的作用。其中I类限制性内切酶通常其切割位点距离识别位点可达数千个碱基的距离，如：EcoB，EcoK。Ⅲ类限制性内切酶可识别短的不对称序列，切割位点与识别位点通常距20多个碱基对，如EcoPI。Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶，只具有认知切割的作用，修饰作用由其它蛋白执行。所识别的位点多为短的回文序列，所切割序列常即为识别位点。这种限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。限制酶的分类Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性a.具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序,在特定位点切割DNA分子b.产物具有黏性末端或平整末端EcoRI第一位：E为大肠杆菌E.coli属名的第一个字母，第二、三位：种名的头两个字母co第四位：菌株R第五位：罗马字，从该细菌中分离出来

的这一类酶的编号。限制性内切酶的命名

限制酶的命名：属名种名菌株EcoRI编号HindⅢ流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）应用于克隆、测序、检测DNA等讨论质粒的构建四、核酸的紫外吸收由于碱基具有共轭双键体系，使核酸在260-290nm波长范围内有独特的紫外吸收，最大吸收峰在260nm附近。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。OD260的应用?/nmA260300220260核酸在260nm附近有最大吸收值，据此特性可定性和定量检测核酸和核苷酸。（蛋白质在280nm有一吸收峰）1判断核酸样品的纯度。纯DNAA260/A280值1.8（实验中通常（1.65-1.85））纯RNAA260/A280值=2.0若含有杂蛋白等，则A260/A280比值明显降低。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出含量。A260=1,相当于50μg/ml双螺旋DNA或40μg/ml单链DNA（或RNA）或20μg/ml寡核苷酸2定量测定核酸纯品：核酸溶液的紫外吸收可以用摩尔磷吸光系数?(p)来表示，测定核酸的?(p)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。A：样品的光吸收值C：每升溶液中磷的摩尔数L：比色杯内径?(p):摩尔磷吸光系数3判断DNA是否变性：核苷酸﹥单链﹥双螺旋；RNA﹥DNA；核酸的光吸收比其各核苷酸成分的光吸收值之和要少30％－40％，这是双螺旋中碱基紧密堆积在一起造成的。在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应，这是因为双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收）；在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数又减小（减色效应）。DNA的紫外吸收光谱核苷酸﹥变性DNA﹥天然DNA五、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键及碱基堆积力的破坏，变成单链结构的过程。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。（一）变性(denaturation)骤然冷却核酸变性特征OD260增高（增色效应）粘度下降沉降系数和浮力密度增加（变性聚集）旋光偏振光改变 酸碱滴定曲线改变 生物活性部分或全部丧失RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。（1）温度；加热到80～100℃（热变性）（2）pH改变（3）化学试剂：尿素、甲醛（4）离子强度（5）其它理化因素：紫外线、X射线及荧光染料处理等引起核酸变性的因素（1）热变性DNA热变性曲线AT区先解链GC区后解链DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。螺旋双链开始局部分开螺旋双链一半解开Tm值将DNA溶液进行加热变性过程中，使DNA的双螺旋结构失去一半（A260达到最大值的50%）时的温度称为该DNA的熔点，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82—95℃之间与其它有机固体物质类似，DNA分子也有特定“熔点”。(1)DNA的均一性均一性愈高的样品，变性过程的温度范围愈小。(2)G-C之含量。因为GC对含3个氢键，A