当酶标半抗原与抗体结合后.pptVIP

（5）终止液常为浓酸或浓碱★建立某一ELISA测定，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，选择阳性结果吸光度值在1.0左右，阴性结果小于0.2的最高稀释度为合适浓度。2.反应条件的选择3.测定方法的标准化试剂盒的标准化生产由厂家在生产试剂盒时进行测试完成检测的标准化由工作人员进行，应力求各个操作步骤的标准化(a)加样(b)pH值(c)温度(d)孵育时间(e)洗涤(f)比色标准化操作程序（SOP）ELISA全自动化检测仪酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最小检测限为ng甚至pg水平。四、酶免疫测定的应用1．将Fab’或F(ab’)2片段与固相载体交联，提高测定的特异性。2．过量抗体的非竞争法将逐步取代限量抗体的竞争法，前者的灵敏度和可测范围至少可比后者大6-10倍。3．随着酶免疫技术与放大系统及自动化原理相结合，使酶免疫分析检测更敏感、更特异、更客观、更准确。五、发展趋势在双抗体夹心法的基础上发展而来，所检测抗原有两个不同的抗原决定簇，两种针对不同抗原决定簇的单克隆抗体可同时和抗原反应，生成夹心式“三明治”复合物。2.双位点一步法双位点一步法测抗原示意图钩状效应（hookeffect）当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。（类似于沉淀反应中抗原过剩的后带现象）应用如：乙型肝炎表面抗原的检测（HBsAg）测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。3.竞争法AgE+AbAgEAbAgAbAg+竞争法示意图所谓间接法是指利用酶标记的抗抗体（即二抗）来检测与固相抗原结合的抗体。1.间接法测抗体检测抗体的方法间接法检测抗体示意图1.Antigencoating2.Sample(humanantibody)3.Anti-(human)Ig-enzymeEEE4.Substrate5.Stopsolution国际通用的标准板形是8X12的96孔式附：酶标仪图附：OD值[antibody]吸光度与抗体浓度标准曲线只要更换不同的固相抗原，用一种酶标抗抗体就可检测出各种相应的抗体。优点应用人体内多种自身抗体检测，如：抗CCP抗体、抗心磷脂抗体等2.竞争法抗体的检测一般不采用竞争法。抗体的竞争法测定不同于单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法。测定可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力影响。亲和力的差异易造成部分无法解释的结果。E酶标Ab待测AbHBeAb竞争法（传统）固相Ag固相Ab待测Ab中和AgE酶标Ab中和AgE酶标Ab显色强弱与待测含量呈反比HBeAb竞争法（改良）4.捕获法测IgM抗体血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，再测定特异性IgM。捕获法测IgM抗体示意图应用：如：检测乙肝IgM型抗体捕获法测IgM抗体实际上夹心法的两次运用RF的干扰亲合素：Avidin生物素：Biotin6.BAS-ELISA（参见相关章节）1个亲合素可以和4个生物素分子亲密结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，一经结合就极为稳定。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。System生物素亲合素-ELISABAS-ELISA法示意图待检标本应用由于BAS-ELISA法的放大作用，可对体内含量极微的物质进行检测，例如：细胞因子、粘附分子等的检测。不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计ELISA方法可有所不同，但都是在以上几种经典方法的衍化和变通。ELISA技术要点包括三个方面：三、ELISA的技术要点试剂制备反应条件的选择操作的标准化（2）固相载体选择（1）抗原和抗体的选择（5）终止液（4）底物（3）酶的选择及标记过程1.试剂制备（1）抗原和抗体★酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjugate)要求：抗原纯度高、抗原性完整抗体特异性好,效价高,亲和力强,比活性高用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆，效果为：Fab段单克隆多克