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RNA干扰技术对三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶基因的功能解析与应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

在现代生物技术与微生物研究的交叉领域中，丝状真菌三孢布拉氏霉菌（Blakesleatrispora）以其独特的生物学特性和重要的工业应用价值，成为了研究的焦点之一。作为目前唯一可实现工业化生产类胡萝卜素的优良菌种，三孢布拉氏霉菌生长迅速，生物量高，菌体内甲羟戊酸途径代谢流量大，能够高效合成如β-胡萝卜素和番茄红素等类胡萝卜素。这些类胡萝卜素不仅在食品、化妆品和制药等行业中被广泛用作天然色素和功能性添加剂，还因其抗氧化、免疫调节等生理活性，对人类健康具有重要意义。

然而，尽管三孢布拉氏霉菌在工业生产中展现出巨大潜力，对其遗传学研究却相对滞后。深入探究三孢布拉氏霉菌的基因功能和代谢调控机制，对于进一步优化其类胡萝卜素生产性能、提高产量和质量具有关键作用。在众多研究基因功能和调控机制的技术中，RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术脱颖而出，成为了一种强大的研究工具。

RNAi技术通过引入与靶基因互补的双链RNA（dsRNA），引发细胞内的RNA降解机制，从而特异性地抑制靶基因的表达。这一技术具有快速、高效、特异性强等优点，与传统的基因敲除方法相比，无论是在沉默基因的效率还是实验周期上，都具有无可比拟的优势。将RNAi技术应用于三孢布拉氏霉菌的研究，不仅能够深入揭示其基因功能和代谢调控网络，还为通过基因工程手段改造菌株，提高类胡萝卜素产量和品质提供了新的策略和方法。

本研究聚焦于三孢布拉氏霉菌的番茄红素环化酶基因，利用RNAi技术对其进行研究。番茄红素环化酶在三孢布拉氏霉菌的类胡萝卜素合成途径中起着关键作用，它催化番茄红素向β-胡萝卜素的转化。通过抑制番茄红素环化酶基因的表达，有望阻断这一转化过程，从而提高番茄红素的积累量，为番茄红素的工业化生产提供新的技术途径。此外，本研究还将建立一套完整的适用于三孢布拉氏霉菌的RNAi技术路线和方法，为后续深入研究三孢布拉氏霉菌的基因功能和代谢调控机制奠定基础，也为RNAi技术在丝状真菌中的广泛应用提供实验基础和理论依据。

1.2国内外研究现状

在三孢布拉氏霉菌基因研究方面，国内外学者已取得了一定成果。对其类胡萝卜素生物合成途径的研究较为系统，明确了hmgR、carRA和carB等是类胡萝卜素合成途径中3个关键酶的编码基因。其中，carRA基因的R位点编码番茄红素环化酶，A位点编码八氢番茄红素合成酶，这些关键基因的确定为深入研究三孢布拉氏霉菌的代谢调控奠定了基础。在菌株性能提升方面，传统诱变方法如紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、亚硝基胍诱变等被广泛应用，通过这些方法对三孢布拉氏霉菌进行处理，筛选出了一些类胡萝卜素产量提高的菌株。采用多种诱变方式联合使用，以及针对代谢途径中相关酶活性进行筛选等策略，也取得了一定成效，如通过N+离子注入联合亚硝基胍诱变，获得了番茄红素产量显著提高的突变株。

在RNA干扰技术应用方面，其在基因功能研究、疾病治疗、药物作用靶点筛选等诸多领域得到广泛应用。在病原性真菌研究中，RNAi技术被用于探究真菌基因功能和致病机制，为开发新型抗真菌药物提供了理论依据。在丝状真菌研究中，虽然RNAi技术的应用相对较少，但已有研究尝试将其应用于丝状真菌的基因功能验证和代谢调控研究。然而，目前RNAi技术在三孢布拉氏霉菌中的应用还处于探索阶段，存在一些尚未解决的问题。例如，如何高效地将干扰RNA导入三孢布拉氏霉菌细胞，并实现稳定的基因沉默效果；如何优化RNAi技术体系，提高其在三孢布拉氏霉菌中的特异性和有效性等，这些问题都有待进一步研究和解决。

1.3研究目的与内容

本研究旨在利用RNA干扰技术，深入探究三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶基因的功能及其在类胡萝卜素代谢调控中的作用，为提高番茄红素产量和优化三孢布拉氏霉菌发酵生产工艺提供理论依据和技术支持。

围绕这一核心目标，本研究的主要内容包括：针对三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶基因（carRA）序列的CDS区，设计并筛选有效的RNAi干扰靶点，通过同源性比对确保靶点的特异性。设计并人工合成靶向carRA基因的短发卡状（shorthairpinRNA，shRNA）序列及阴性对照序列，将其定向克隆到小干扰RNA（ShortinterferingRNA，siRNA）表达载体mU6pro上，构建干扰质粒，并通过双酶切与测序法鉴定目的产物。系统研究三孢布拉氏霉菌的原生质体制备及再生条件，包括摸索菌体培养时间、酶种类、酶浓度、酶解pH、酶解时间、酶解温度、酶解方式、预处理方式等因素对原生质体形成和再生的影