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细胞培育标准操作程序

一、引言

细胞培育，作为现代生命科学研究与生物技术发展的核心技术之一，其操作的规范性、严谨性直接关系到实验结果的可靠性、可重复性乃至后续研究的成败。本标准操作程序（SOP）旨在为细胞培育相关实验操作提供一套系统、科学的指导框架，确保操作者能够在受控条件下进行细胞的复苏、培养、传代、冻存及质量监控等关键步骤。遵循本程序有助于最大限度地减少污染风险，维持细胞的生物学特性稳定，并保障实验数据的高质量产出。本SOP适用于常规哺乳动物细胞系的实验室培养，特殊细胞类型的培养可在此基础上进行针对性调整。

二、实验室环境与安全要求

细胞培育对环境条件要求苛刻，良好的环境控制和严格的安全规范是实验顺利进行的前提。

2.1实验室环境

*洁净度：细胞培养实验室应保持清洁、干燥、通风良好。定期对地面、桌面、超净工作台及培养箱等进行清洁消毒。

*温湿度控制：实验室温度宜控制在室温范围，相对湿度一般建议在40%-60%之间。细胞培养箱内的温度、CO2浓度和湿度需每日监控并记录。

*分区操作：有条件的实验室应划分试剂准备区、样本处理区、细胞培养区等，避免交叉污染。尤其注意，可能产生气溶胶的操作（如离心）应在生物安全柜内进行。

2.2个人防护装备（PPE）

所有进入细胞培养区域的人员必须严格遵守个人防护规定：

*穿着专用的实验服或隔离衣，袖口应收紧。

*佩戴一次性手套，并在操作过程中定期更换，尤其在接触不同细胞系或疑似污染物品后。

*根据操作风险评估，必要时佩戴护目镜或面罩，以防止液体飞溅造成眼部或面部污染。

*长发应束起，不佩戴首饰，不涂抹指甲油。

2.3生物安全柜的使用与维护

生物安全柜是细胞培养的核心设备，其性能直接影响无菌操作的效果：

*操作前检查：启动生物安全柜，确认其正常运行，气流方向正确。操作前应使用75%乙醇擦拭工作台面及内壁。

*操作规范：物品放置合理，避免阻挡气流。操作时，手臂应缓慢进出，避免在柜内快速移动或频繁打开玻璃门。

*操作后清洁：操作结束后，再次用75%乙醇擦拭台面，关闭紫外灯（若使用），让风机继续运行一段时间后再关闭。

*定期维护：按照制造商建议定期进行高效空气过滤器（HEPA）的完整性检测和更换，以及柜内气流速度的校准。

三、试剂与耗材准备

高质量的试剂和合格的耗材是保证细胞良好生长的物质基础。

3.1主要试剂及其储存

*细胞培养基：根据细胞类型选择合适的培养基。商品化培养基通常为液态或粉末状。粉末培养基需按说明书准确配制，经无菌过滤后分装保存。液体培养基开封后应在4℃冰箱避光保存，并在有效期内使用。使用前需预热至37℃。

*血清：胎牛血清（FBS）是常用的细胞培养添加剂，需-20℃冻存。使用前应逐步解冻（建议4℃过夜或37℃水浴快速解冻），并分装成小体积以避免反复冻融。血清的批次筛选对细胞生长至关重要。

*抗生素：如青霉素-链霉素混合液，通常在培养基中添加以预防细菌污染。应按照推荐浓度使用，长期培养需评估其对细胞的潜在影响。

*消化液：常用胰蛋白酶-EDTA溶液，用于贴壁细胞的消化传代。需-20℃冻存，使用前预热至37℃。

*平衡盐溶液：如PBS（磷酸盐缓冲液），用于清洗细胞。

*其他添加剂：根据细胞特殊需求添加，如生长因子、谷氨酰胺等。

3.2耗材准备与无菌处理确认

*耗材选择：应选用经过无菌处理的一次性细胞培养耗材，如培养瓶/皿、离心管、移液管、吸管头等。

*包装检查：使用前检查包装是否完好无损，有无过期。

*无菌操作区准备：将所需耗材在超净工作台内按操作顺序摆放，并用75%乙醇擦拭外包装后再打开。

四、细胞培养基本操作技术

4.1无菌操作基本原则

无菌操作是细胞培养的灵魂，贯穿于所有操作环节：

*操作区域消毒：超净工作台面、双手（戴手套前）、试剂瓶/培养瓶外壁均需用75%乙醇仔细擦拭。

*避免交叉污染：不同细胞系操作需更换手套和耗材，最好分时段或在不同生物安全柜内进行。

*开盖技巧：试剂瓶或培养瓶的盖子打开后，开口应朝向酒精灯火焰（若使用）或远离操作者，避免手或污染物直接接触开口边缘。操作完毕后及时盖紧盖子。

*吸管/移液枪使用：吸管尖端避免触碰非无菌表面。移液枪枪头应一次性使用，安装枪头时避免手接触枪头部分。

*操作沉稳：动作应轻柔、准确，避免液体溅出或产生气溶胶。

4.2细胞复苏

细胞复苏是将冻存的细胞恢复至活性生长状态的过程，关键在于快速解冻以减少冰晶损伤。

*准备工作：提前将预热至37℃的完全培养基、PBS（若需）、离心管等放入超净工作台。

*快速解冻：从液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中快速