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PRRSVN基因的原核表达、蛋白纯化及间接ELISA方法构建与应用研究

一、引言

1.1研究背景

猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一种对全球养猪业危害极为严重的传染病。自20世纪80年代末首次被发现以来，PRRS迅速在世界各地传播蔓延，给养猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV主要侵害猪的生殖系统和呼吸系统，感染母猪会出现繁殖障碍，如早产、晚期流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等，同时伴有发热、厌食等症状；感染仔猪则主要表现为呼吸道症状，如呼吸困难、咳嗽、喘气等，还可能出现神经症状，生长发育受阻，死亡率显著升高。除了这些直观的危害，PRRSV还具有持续性感染的特点，感染猪在康复后仍能长期排毒，成为重要的传染源，使得疫情难以彻底根除。并且，PRRSV具有高度的变异性，不同毒株之间的抗原性和致病性存在较大差异，这使得疫苗的研发和防控工作面临巨大挑战。

据相关统计数据显示，PRRS每年给全球养猪业带来的经济损失高达数十亿美元。在我国，养猪业是农业的重要支柱产业之一，PRRS的流行也给养猪业造成了沉重打击。例如，2006-2007年我国爆发的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS），疫情迅速蔓延至全国大部分地区，导致大量母猪流产、死胎，仔猪死亡率大幅上升，许多养猪场遭受了严重的经济损失，一些小型养猪场甚至因此倒闭。即使在疫情相对稳定的时期，PRRS也会持续影响猪群的健康和生产性能，增加养殖成本，降低养殖效益。因此，PRRS的防控一直是养猪业面临的重要难题。

在PRRSV的众多蛋白中，N蛋白（核衣壳蛋白）具有重要的生物学功能。N蛋白由ORF7基因编码，是PRRSV基因组中最为保守的区域之一。它不仅在病毒粒子的组装和稳定中发挥关键作用，还参与了病毒的复制、转录和翻译等过程。同时，N蛋白具有较强的免疫原性，能够刺激机体产生特异性抗体，是PRRSV血清学诊断和疫苗研发的重要靶蛋白之一。对PRRSVN基因进行深入研究，对于开发高效的诊断技术和防控措施具有重要的理论和实践意义。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过对PRRSVN基因进行原核表达，获得大量高纯度的N蛋白，并在此基础上建立一种间接ELISA检测方法，用于PRRSV抗体的检测。具体研究目的如下：

克隆PRRSVN基因，并将其导入原核表达系统进行表达，优化表达条件，提高N蛋白的表达量。

对表达的N蛋白进行纯化，获得高纯度的N蛋白，为后续的研究和应用提供物质基础。

以纯化的N蛋白为抗原，建立间接ELISA检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。

本研究的意义主要体现在以下几个方面：

为PRRS的诊断提供新的技术手段。目前，PRRS的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、RT-PCR、免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。其中，ELISA方法因其具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，被广泛应用于PRRSV抗体的检测。然而，现有的ELISA检测方法大多使用全病毒或重组蛋白作为抗原，存在一定的局限性。本研究建立的以原核表达N蛋白为抗原的间接ELISA检测方法，具有更高的特异性和敏感性，能够更准确地检测PRRSV抗体，为PRRS的诊断和疫情监测提供有力的技术支持。

有助于PRRS的防控。及时准确地检测出猪群中的PRRSV抗体，对于了解猪群的免疫状态、评估疫苗的免疫效果、制定合理的免疫程序以及采取有效的防控措施具有重要意义。通过本研究建立的间接ELISA检测方法，可以对猪群进行大规模的抗体检测，及时发现感染猪和潜在的传染源，采取隔离、扑杀等措施，防止疫情的扩散和蔓延，从而有效降低PRRS对养猪业的危害，保障养猪业的健康发展。

为PRRS相关研究提供基础。原核表达的N蛋白不仅可以用于ELISA检测方法的建立，还可以作为抗原用于制备单克隆抗体、多克隆抗体等，为PRRSV的抗原表位分析、病毒与宿主细胞的相互作用机制研究等提供重要的实验材料。同时，本研究建立的间接ELISA检测方法也可以应用于PRRS疫苗的质量评价、免疫效果监测等方面，推动PRRS疫苗的研发和改进。

1.3国内外研究现状

在PRRSVN基因原核表达方面，国内外众多学者已开展了大量研究。早期研究主要集中在将N基因克隆至不同原核表达载体并在大肠杆菌中表达，如