奶牛乳腺炎致病菌关键基因克隆表达及免疫原性研究——以金黄色葡萄球菌凝聚因子A A区基因为例.docxVIP

奶牛乳腺炎致病菌关键基因克隆表达及免疫原性研究——以金黄色葡萄球菌凝聚因子AA区基因为例

1.引言

1.1研究背景

1.1.1奶牛乳腺炎的现状

奶牛乳腺炎（bovinemastitis）作为奶牛养殖中最为常见且危害严重的疾病之一，给全球奶牛养殖业带来了沉重的打击。据世界奶牛协会统计，全球约2.2亿头奶牛中，三分之一患有不同类型的乳腺炎。我国奶牛业每年因乳房炎造成的损失平均每头牛约为2000-3600元，美国每年因奶牛患乳腺炎造成的经济损失高达20亿美元，而全球每年的总损失更是超过100亿美元。这些损失主要源于产奶量的显著下降，治疗费用、废弃奶、牛死亡和淘汰的增加，以及奶品质的降低等多个方面。其中，产奶量减少所造成的损失占总损失的69％-80％。当奶牛患上乳腺炎，机体会产生大量白细胞来对抗病原菌和修复受损组织，这些白细胞聚集会堵塞部分乳腺管道，阻碍乳汁排出，致使部分泌乳细胞停止泌乳并最终萎缩，进而影响整个胎次甚至终生的产奶量。同时，乳腺炎还会导致鲜奶质量下降，奶中大量的体细胞污染鲜奶，影响乳制品的质量和风味，牛奶中体细胞过多会降低乳蛋白、乳糖和乳脂肪的含量，并且作为炎症反应的结果，流向乳腺系统的血液蛋白增加，钙和氯的含量也增加，极大地影响了牛奶的营养价值。

1.1.2金黄色葡萄球菌与奶牛乳腺炎

在引发奶牛乳腺炎的众多病原微生物中，金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）占据着主要地位。它是一种革兰氏阳性菌，直径0.5-1.5μm，菌落呈葡萄串状排列，广泛分布于自然界，属于条件性致病菌。在Baird-Parker平板上培养时，可生成周围有浑浊带、外层有透明圈的黑色菌落。金黄色葡萄球菌致病性极强，能引起人和动物的多种疾病，是重要的人兽共患病原菌。它主要通过表面蛋白和多糖黏附乳腺上皮细胞并侵入内部，然后借助肽酶和凝集素来破坏乳腺组织和细胞膜，还可在吞噬细胞内生存，侵入乳腺组织形成脓肿，最终导致纤维化。该菌感染乳腺后，可使感染乳区在2-6h内迅速发生急性坏疽，若不及时治疗，毒素被机体吸收后，奶牛将在1-2d内死亡，死亡率达100％，且具有传染性，常导致整个牛场乳腺炎的蔓延。此外，金黄色葡萄球菌感染奶牛的部位主要有乳房、损伤的乳头、乳头导管、扁桃体、阴道及躯体不健康皮肤，一旦定居便极难根除，会导致可触知的纤维化，破坏乳腺组织，使受感染乳腺泌乳功能下降或丧失。

1.1.3凝聚因子A（ClfA）的研究进展

凝聚因子A（clumpingfactorA,ClfA）是金黄色葡萄球菌的一种负责黏附与凝集的表面蛋白。其A区基因是信号肽和A区结构域（包括N2结构域、A结构域）的共同部分，对其黏附性和凝集性起着关键影响。ClfA能够促进细菌在宿主血液中的聚集和凝固，帮助细菌逃避免疫系统的攻击。在金黄色葡萄球菌感染过程中，ClfA与宿主的纤维蛋白原结合，使细菌能够黏附在宿主组织表面，进而侵入宿主细胞，引发感染。目前，针对ClfA的研究主要集中在其作为疫苗靶点的潜力上。研究人员尝试将ClfA与其他关键蛋白融合，开发多功能的融合蛋白疫苗，在动物模型中已显示出一定的保护效果，能够刺激产生强烈的免疫反应，包括抗体的产生和细胞免疫的激活。然而，仍有许多问题亟待解决，如疫苗的最佳剂量和接种方案的确定，疫苗在不同人群和动物中的效果评估，以及疫苗的安全性和稳定性等方面，都需要进一步深入研究。

1.2研究目的和意义

1.2.1目的

本研究旨在克隆表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌凝聚因子AA区基因，通过对该基因的克隆、表达及相关蛋白质的研究，深入探究其在奶牛乳腺炎致病过程中的作用机制，明确ClfAA区基因与金黄色葡萄球菌致病性之间的关联，为后续研究提供基础数据和理论支持。

1.2.2意义

从理论层面来看，对奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌凝聚因子AA区基因的克隆表达研究，有助于进一步揭示金黄色葡萄球菌的致病机理，深入了解其在感染过程中的分子机制，丰富对该病原菌致病机制的认识，为相关领域的理论研究提供新的思路和方法。从实践角度而言，本研究为奶牛乳腺炎的防治策略提供了重要的理论依据。通过深入了解ClfAA区基因的功能和作用机制，可以开发出更加有效的诊断方法和治疗手段，提高奶牛乳腺炎的防治效果。此外，该研究还有助于生物工程疫苗的开发，为预防金黄色葡萄球菌性乳腺炎提供新的途径和方法，降低奶牛乳腺炎的发病率，减少经济损失，促进奶牛养殖业的健康发展。

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与载体

实验选用的金黄色葡萄球菌菌株分离自临床患有乳腺炎的奶牛乳汁样本，该菌株经过形态学观察、生化鉴定以及16SrDNA测序等多重鉴