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分子荧光光度法

第一节概述

一、光致发光

物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射(发光)或非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。物质分子吸收外来光被激发后

所产生的发光现象，叫光致发光。

荧光10-⁹~10-6s实用

磷光10-³~10s不实用

二、荧光光度法

利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为荧光光度法，即荧光法。

优点：灵敏度高，10-7~10-9g/ml,比紫外分光光度法灵敏度高10~1000倍。

第二节基本原理

一、荧光的产生

基态激发光激发态去激发基态

(一)激发处于基态的物质分子吸收光能时，其电子

对中的一个电子被激发到某一较高能级。

基态单重态所有电子都自旋配对的分子电子态。

激发态激发单重态S₁S₂……

激发三重态T₁T2……

(二)去激发指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射方式回到基态的过程。

1、振动驰豫

同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动

能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。

2、内转移两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式传递给溶剂分子。

去激发

无辐射跃迁

(热的形式)

磷光

振动驰豫

内转移

体系间跨越

外转移

辐射跃迁荧光

l

意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态(如S₁、S₂、S……),它都能通过内转移和振动驰豫到达S₁的最低振动能级上。

一般情况下，S₁与S₀之间很难发生内转移；T₁与S₀之间发生内转移的几率要大些。

3、体系间跨越

电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。

4、外转移

激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的

外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称“猝灭”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机

率大，所以室温下很难见到磷光。

5、荧光发射

电子由第一激发单重态S₁(最低振动能级)跃迁至基

态S₀而发射的光叫荧光。

6、磷光发射

电子由第一激发三重态T₁跃迁至基态S₀而发射的光叫

磷光。

振动驰豫10-12～10-14S

内转移10-11～10-13S

荧光10-6~10-⁹S

磷光10-4~10S

跃迁方式时间

荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。

1、分子结构

(1)π→π*跃迁能产生较强荧光。——产生荧光的主要

跃迁类型

(2)含π-π共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧光效率越大。

(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。

(4)取代基效应：斥电子基→ψ4个

吸电子基→ψ↓

重原子→ψ↓

发射荧光的分子数

被激发的分子总数

荧光效率：

4f=

二、影响荧光的因素

2、环境因素

(1)温度温度个→荧光效率↓

(2)溶剂极性个→荧光个

(3)溶液pH值影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液pH值。

(4)荧光熄灭剂(卤素离子、重金属离子等等)

3、荧光物质浓度

自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间

碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。

pH7~12蓝色荧光

pH13无荧光

pH2无荧光

第三节荧光光度计

原理图

荧光测量应在垂直激发光方向上

进行。

一、光源

特点：光强度大，适用范围宽。

常用：高压汞灯，氙灯，溴钨

灯，激光，脉冲激光

二、单色器

干涉滤光片，光栅

三、样品池

石英杯

日立850型荧光分光光度计

四、检测器

光电倍增管

第四节定量分析方法

原理：一定条件下，荧光强度(I)与浓度(c)呈线性关系。

I。=Kc

定量分析的依据

方法：标准曲线法和标准对比法

第五节分析条件的选择

线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除

一、线性范围的选择

荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。

二、选择激发波长和荧光波长

1、激发波长的选择

激发光谱：将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激发光谱。

一般选择最大激发波长作为激发光波长。

2、荧光波长的选择

荧光光谱：用最大激发波长的激发光