生物化学 第14章 基因重组和基因工程(临本).ppt

Holliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐； Holliday intermediate的电镜照片 利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊 把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病人对白蛋白的需求。 转基因抗冻西红柿transgenic anti-chilling tomatoes 延熟保鲜的转基因番茄转基因（transgenic anti-ageing tomatoes） 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理及操作步骤 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 （三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切位点。 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(PCR) 思考题 何为同源重组,其特点是什么?holliday中间体是什么? 什么是接合作用(conjugation)、转化作用（transformation）、转导（transduction） 何为转座? 常见的两种转座子是什么?组成上有什么特点？ 什么是基因工程(genetic engineering),基因工程包括哪些基因步骤？ 基因工程的手术刀-限制性核酸内切酶在识别序列和切割上有什么特点？ 目的基因获得的方法有哪些？ 作为基因工程的载体应具有哪些特点? 1、显微注射法 (Microinjection technique) 在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。 2、电穿孔法 在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。 方法适应不同细胞如细菌、酵母、植物及动物细胞。 需电穿孔仪。 3、DNA-磷酸钙共沉淀法 将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。 小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。 更换培养液使外源DNA在细胞中表达，筛选转化细胞或分析外源基因的表达量。 4、DEAE-右旋糖苷法 该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。 方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。 通常只用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。它对BSC-1，CV-1和COS细胞转染较好，因此应用上有限制。 5、逆转录病毒载体 逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法:原位杂交、Southern印迹等。 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 （五）重组体的筛选 (插入失活法) 抗药性标记选择 带有双抗生素的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都生长，DNA重组体只能在其中一种抗生素培养基上生长。 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 α互补原理筛选重组体pUC18 如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β –半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物