自体PRP对成骨细胞骨涎蛋白表达影响.pdf

目 录 中文摘要……………………………………………．1 英文摘要……………………………………………．4 研究论文 自体PRP对成骨细胞骨涎蛋白表达的影响…………．．9 前日U 言…………………………………………．9一舌…………………………………………． 材料与方法…．．…………………………………．．10 结 果…………………………………………20 附 图…………………………………………23 附 表…………………………………………31 讨 论…………………………………………32 结 论…………………………………………36 参考文献…………………………………………37 综述骨涎蛋白在成骨过程中的作用及影响因素………………39 致 谢……………………………………………54 个人简历……………………………………………55 中文摘要 自体PRP对成骨细胞骨涎蛋白表达的影响 摘 要 目的：随着人们生活水平的提高，人们对口腔种植的需求逐渐增加。 合”理论，种植技术和理论研究得到飞快的发展。目前口腔种植中常见的 问题主要为不能形成良好骨结合和局部骨量不足的问题，为了解决这个问 题，很多学者做了大量的相关研究。骨髓基质干细胞(BMSCs)是组织工程 理想的种子细胞，它可以在体外定向诱导为成骨细胞。富血小板血浆 (PRP)被刺激后可以释放大量的生长因子，这些生长因子可以促进骨缺 损的修复和重建。骨涎蛋白(BSP)是成骨细胞分化成熟的标志，在成骨 细胞矿化的晚期特异性表达。本研究体外诱导兔BMSCs分化为成骨细胞， 将兔全血所制备的白体PRP作用于成骨细胞，探讨自体PRP在不同时间 段对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响，进一步揭示PRP的作用机制， 为临床中合理使用PRP提供实验依据。 方法：OBMSCs的培养：将3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳 缘静脉麻醉，以16号骨髓穿刺针抽取胫骨骨髓4．6ml离心后接种于培养 瓶，待细胞达到70～80％贴壁融合后进行传代，用倒置显微镜观察原代及 传代细胞形态。②绘制细胞生长曲线：将生长良好第三代BMSCs配制成 进行计数，每组设3复孔，连续观察10天后绘制细胞的生长曲线。③PRP 的制备：取同一只新西兰大白兔，经耳缘静脉麻醉，分离颈总动脉并抽取 全血，采用二次离心法分离兔全血并制备PRP，并在检验室检测所制备 PRP和兔全血血小板数目。新鲜获取的PRP以牛凝血酶激活后，立即加 入到细胞培养系中。④实验分组：实验组加入含20％PRP的含矿化诱导 液的无血清完全DMEM培养液：对照组加入不含PRP的含矿化诱导液的 无血清完全DMEM培养液。每组设3复孔。⑤成骨细胞的鉴定：取第3 代生长良好的BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后，以碱性磷酸酶染色 法及钙结节茜素红染色法验证其具有成骨分化能力。⑥成骨细胞增殖检 测：应用MTT法分别检测第l、4、7、10d实验组和对照组中成骨细胞 中文摘要 的增殖情况，其中每组设定3个复孔。⑦成骨细胞碱性磷酸酶活性检测： 应用碱性磷酸酶检测试剂盒分别检测第4、7、10、14d实验组和对照组细 胞中碱性磷酸酶的含量，每组设定3个复孔。⑧成骨细胞骨涎蛋白表达检 组和对照组中成骨细胞骨涎蛋白的表达情况。 结果：①BMSCs细胞形态学观察：原代培养5d后，细胞呈短梭形、 梭形、三角形或多角形，多个细胞聚集成集落，呈散在分布，随着培养时 间的延长，细胞数目明显增多，11．12d左右，可见细胞铺满瓶底的80．90％， 贴壁细胞呈长梭形、纺锤形排列，紧密排列类似集束状、漩涡状，传代后 的细胞增殖速度明显加快，传3代以后细胞形态较为均一，细胞数量增多， 形态呈现长梭形或者纺锤体样，细胞整体呈鱼群样、漩涡状或平行排列。 细胞的生长曲线显示：1—2d为潜伏期，细胞增殖不明显，3d后细胞增殖 明显加快，进入对数生长期，7d后增殖变慢为平台期，之后细胞数目趋 于平缓。②成骨细胞的鉴定：经成骨诱导后，碱性磷酸酶染色和钙结节茜 素红染色结果均呈阳性表达，表明所培养的BMSCs可以体外诱导为成骨 细胞，并具有矿化能力。③PRP的检测：PRP中的