丙型肝炎检测.ppt

（二）HCV核酸检测的方法 1、RT-PCR检测技术 传统PCR定性检测HCV RNA需要三个步骤：①对待测样品进行处理：通过裂解、纯化，提取样品中的HCV RNA作为PCR扩增的模板；②采用逆 转录PCR（RT-PCR）技术对提取到的HCV RNA进行扩增；③检测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳和PCR-酶联免反应（PCR-ELISA）等。 第三十一页，共53页 2、TMA检测技术 TMA是一种利用MMLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA的反应系统。TMA使用的引物含有T7 RNA聚合酶 结合位点，使得反转录合成的cDNA可以作为T7 RNA聚合酶的模板，在T7 RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷贝。扩增出来的RNA重新进入TMA 循环，成为下一轮复制的模板。TMA优点在于特异性强、灵敏度高，反应条件简单、扩增只需一个温度，无需专门的热循环仪器，且因整个反应在一个试管中进行，扩增产物RNA易于降解，从而大大减少了污染的可能。 基于TMA技术的VERSANT HCV RNA定性检测可检测到极低水平的HCV RNA，甚至可低至5IU/ml。 第三十二页，共53页 3、实时荧光定量PCR技术 荧光定量PCR基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理，当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为FRET。基于FRET原理，出现了不同种类的荧光PCR，主要体现在探针设计的不同，如TaqMan探针、分子信标和荧光杂交探针。以目前我国应用最广泛的TaqMan荧光标记探针的定量PCR为例，是在探针（probe）的两端偶联一个短波长的荧光基团（报告基团）和一个长波长的荧光淬灭基团，这两个基团位置靠近，荧光基团不发荧光；Taq酶在发挥5'→3'方向聚合酶活性的同时，还具有5'→3'方向的外切酶活性，可使探针降解，荧光淬灭基团从而解离、远离荧光基团，荧光基团发出荧光，荧光的强度与PCR产物的量相关，通过计算可得出具体的量值。 第三十三页，共53页 荧光定量PCR检测HCV RNA的操作程序包括：RNA提取、PCR扩增、荧光检测及结果分析。目前一般的荧光定量PCR仪都带有相应的分析软件，辅助设定阈值及Ct值，也允许操作者在合理的范围内自行调整。一个 良好的PCR反应反映到标准曲线上，就是标准曲线的相关性良好，（r2通常＞0.99），斜率（反映扩增的效率）在指定的范围内。但采用外标法定量的试剂盒标准品扩增良好也不一定意味着样品一定扩增良好，因为还涉及RNA提取质量的问题，因此特别要注意考察阳性质控和阴性质控的结果，阴性结果必须没有扩增曲线，而阳性质控必须扩增曲线良好，结果落入指定的区间 内 。 第三十四页，共53页 4、b-DNA技术 分支DNA（bDNA）技术基于其独特的信号放大系统，即bDNA信号放大系统，这是一个人工合成的bDNA， bDNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。利用序列特异的寡聚核苷酸探针杂交捕捉HCV RNA， HCV RNA随后与支链DNA(bDNA）二级探针杂交， bDNA再与酶联三级探针结合，随后加入酶底物，产生的化学发光信号强度与靶DNA的量成正比。 第三十五页，共53页 操作程序包括：首先激昂血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，HCV RNA释放后加入微孔板中，板孔中包被有可与病毒载体特异结合的一系列靶探针，另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与bDNA结合，加入酶标记物对结合的bDNA进行标记，经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度。本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设定实验样品的病毒拷贝数。 第三十六页，共53页 （三）检测策略及结果报告 1、 HCV核酸定性检测用于血液筛查策略及结果报告 对血液抗-HCV初筛呈阴性反应的样品可用集合NAT（Pooling NAT）进行复检试验。如呈阳性反应，做单人份NAT检测，阳性结果报告“阳性待查”，血液报废，如果需要进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；如呈阴性反应，报告“HCV复检阴性”，血液供应临床。 第三十七