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第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选;基因文库(Genelibrary):由大量的含有基因组DNA(即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库,应该能够保证从中筛选到目的基因。
即Genomiclibrary;cDNA文库:
若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA,而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA,它们所构成的重组DNA克隆群体,则称之为cDNA基因文库;第一节基因组DNA文库的构建;载体的选择:;粘粒克隆所需的克隆子数是?phage的一半,如?需700000时,cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个?phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid,因其在构建文库和贮存文库比?phage困难得多;YAC可用于克隆500kb以上,甚至几Mb的DNA片段
BAC可减少DNA分子间的重组;?phagevectors
早期(70年代后期)使用,如Charon4A和?gt-WES,克隆15~20kb;·选择载体要考虑的因素
易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA
易于制备两臂
载体的可知性,如序列,图谱
载体臂上的琥珀突变,利用特殊筛选系统
重组体中有活性的gam基因
载体臂上的chi序列;Cosmidvector
所有cosmidvector均可用于构建文库,但建议尽量使用pJB8和c2RB,因为经验较多,许多问题易于解决;1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式
n=ln(1-p)/ln(1-f)
n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数
p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率
f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值;哺乳动物3×109kb
若p=99%平均克隆片段20kb
f=20kb/3×109
n=690773.2;用?phage构建文库
1.总DNA的提取
DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍,否则有效片段较少,因此DNA至少应大于100kb(cosmid?200kb);·载体臂的纯化(梯度离心:蔗糖或NaCl)
梯度离心的收获量大,而agarose回收量小
回收无填充片段
聚乙二醇沉淀,除去碎片;3.基因组DNA的消化
一般采用Sau3AI消化
回收20-24kb(agarose法or梯度离心)
·有些载体可做不完全??平
;5.扩增和保存
重组phage可在E.coli中扩增,所得文库可被长时间利用和贮存,可用于多个不同基因的筛选
6.在宿主菌上形成噬菌斑
7.带有目的外源DNA序列的?phage重组体的鉴定
8.对选出的重组phage进行噬斑纯化,再对外源DNA进行分析;载体的去磷酸化,提高连接和包装效率;基因组DNA片段3’凹端的不完全补平;重组体的筛选和分析
噬斑原位杂交;不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目;.杂交筛选用探针
.纯化
.分析/Southern杂交,酶切Sequencing/
其它方法,如免疫学方法
;例如将基因组DNA用多种限制性内切酶切割,
通过Southern杂交
;哺乳动物3×109kb若p=99%平均20kbn=690773.2;第二节cDNA文库的构建;1.RNA的分离;总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力
合成的cDNA也应为上述范围
脱氧胸苷酸12-18聚体[oligo(dT)12-18]引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至少增加30倍;mRNA的丰度:
高丰度mRNA
珠蛋白,免疫球蛋白,卵清蛋白
在特定细胞中占50-90%;;多聚核糖体的免疫学纯化法
用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体
·免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱,单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上,随后用EDTA解离下来,通过oligo(dT)层析分离mRNA。
·此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%
·并非都可用,根据材料\来源\特异性来选择;反转录酶AMV(42℃)M-MuLV(37℃)
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