第十一章-DNA文库的构建和目的基因的筛选.ppt

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第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选;基因文库(Genelibrary):由大量的含有基因组DNA(即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库,应该能够保证从中筛选到目的基因。

即Genomiclibrary;cDNA文库:

若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA,而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA,它们所构成的重组DNA克隆群体,则称之为cDNA基因文库;第一节基因组DNA文库的构建;载体的选择:;粘粒克隆所需的克隆子数是?phage的一半,如?需700000时,cosmid需350000个

如无特殊需要(如单个?phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid,因其在构建文库和贮存文库比?phage困难得多;YAC可用于克隆500kb以上,甚至几Mb的DNA片段

BAC可减少DNA分子间的重组;?phagevectors

早期(70年代后期)使用,如Charon4A和?gt-WES,克隆15~20kb;·选择载体要考虑的因素

易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA

易于制备两臂

载体的可知性,如序列,图谱

载体臂上的琥珀突变,利用特殊筛选系统

重组体中有活性的gam基因

载体臂上的chi序列;Cosmidvector

所有cosmidvector均可用于构建文库,但建议尽量使用pJB8和c2RB,因为经验较多,许多问题易于解决;1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式

n=ln(1-p)/ln(1-f)

n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数

p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率

f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值;哺乳动物3×109kb

若p=99%平均克隆片段20kb

f=20kb/3×109

n=690773.2;用?phage构建文库

1.总DNA的提取

DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍,否则有效片段较少,因此DNA至少应大于100kb(cosmid?200kb);·载体臂的纯化(梯度离心:蔗糖或NaCl)

梯度离心的收获量大,而agarose回收量小

回收无填充片段

聚乙二醇沉淀,除去碎片;3.基因组DNA的消化

一般采用Sau3AI消化

回收20-24kb(agarose法or梯度离心)

·有些载体可做不完全??平

;5.扩增和保存

重组phage可在E.coli中扩增,所得文库可被长时间利用和贮存,可用于多个不同基因的筛选

6.在宿主菌上形成噬菌斑

7.带有目的外源DNA序列的?phage重组体的鉴定

8.对选出的重组phage进行噬斑纯化,再对外源DNA进行分析;载体的去磷酸化,提高连接和包装效率;基因组DNA片段3’凹端的不完全补平;重组体的筛选和分析

噬斑原位杂交;不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目;.杂交筛选用探针

.纯化

.分析/Southern杂交,酶切Sequencing/

其它方法,如免疫学方法

;例如将基因组DNA用多种限制性内切酶切割,

通过Southern杂交

;哺乳动物3×109kb若p=99%平均20kbn=690773.2;第二节cDNA文库的构建;1.RNA的分离;总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力

合成的cDNA也应为上述范围

脱氧胸苷酸12-18聚体[oligo(dT)12-18]引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至少增加30倍;mRNA的丰度:

高丰度mRNA

珠蛋白,免疫球蛋白,卵清蛋白

在特定细胞中占50-90%;;多聚核糖体的免疫学纯化法

用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体

·免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱,单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上,随后用EDTA解离下来,通过oligo(dT)层析分离mRNA。

·此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%

·并非都可用,根据材料\来源\特异性来选择;反转录酶AMV(42℃)M-MuLV(37℃)

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