多聚酶链式反应.ppt

关于多聚酶链式反应一、实验原理：PCR又称多聚酶链式反应，是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，Mg2+存在下，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增数百万倍。第2页,共14页，2024年2月25日，星期天１．DNA模板：反应中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA纯度较高，以增加反应特异性。２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；G+C含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在95℃时30分钟还有50％活力。说明第3页,共14页，2024年2月25日，星期天PCR过程示意图第4页,共14页，2024年2月25日，星期天二、实验所需器材和试剂器材：台式高速离心机，恒温水浴锅，PCR扩增仪，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，Eppendorf离心管，PCR小管第5页,共14页，2024年2月25日，星期天试剂：引物1，引物2，dNTPmix，10XPCRBuffer，TaqDNA聚合酶，EB，上样缓冲液，marker，琼脂糖，TBE缓冲液第6页,共14页，2024年2月25日，星期天三、实验步骤1：加样按次序在PCR小管中加入下列试剂（50ul体系）：5ul10XPCRBuffer4uldNTPmix2ul引物12ul引物23ul模板1ulTaqDNApolymerase加水到总体积50ul第7页,共14页，2024年2月25日，星期天第8页,共14页，2024年2月25日，星期天注意事项：同时设立对照组（对照组不加模板DNA）第9页,共14页，2024年2月25日，星期天2、按以下参数进行PCR扩增（对于不同的PCR反应应设置不同的反应条件）94℃4分钟94℃30秒51℃30秒进行30个循环72℃30秒72℃5分钟4℃第10页,共14页，2024年2月25日，星期天将实验组与对照组放入PCR仪，按设定好的条件进行扩增第11页,共14页，2024年2月25日，星期天3、扩增结束后，取5ul产物进行琼脂糖凝胶电泳以观察结果PCR结果示意图第12页,共14页，2024年2月25日，星期天四、作业1，图示实验结果2，掌握PCR原理、学会分析实验结果第13页,共14页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第14页,共14页，2024年2月25日，星期天